LITOS: ein vielseitiges LED-Beleuchtungsgerät zur optogenetischen Stimulation

Nov 10, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13139 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Optogenetik ist zu einem Schlüsselinstrument zur Manipulation biologischer Prozesse mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung geworden. In jüngster Zeit wurden eine Reihe kommerzieller und Open-Source-Multiwell-Beleuchtungsgeräte entwickelt, um den Durchsatz in optogenetischen Experimenten zu gewährleisten. Verfügbare kommerzielle Geräte bleiben jedoch teuer und mangelhaft an Flexibilität, während Open-Source-Lösungen Programmierkenntnisse erfordern und/oder komplexe Montageprozesse beinhalten. Wir präsentieren ein LED-Beleuchtungstool für die optogenetische Stimulation (LITOS), das auf einer bestückten Leiterplatte basiert und eine handelsübliche 32 × 64-LED-Matrix als Beleuchtungsquelle steuert. LITOS lässt sich schnell und ohne Löten zusammenbauen und verfügt über eine benutzerfreundliche Schnittstelle, die über eine auf dem Gerät selbst gehostete Website zugänglich ist. Komplexe Lichtstimulationsmuster können problemlos ohne Programmierkenntnisse programmiert werden. LITOS kann mit verschiedenen Formaten von Multiwellplatten, Petrischalen und Flaschen verwendet werden. Wir haben LITOS validiert, indem wir die Aktivität des MAPK/ERK-Signalwegs als Reaktion auf verschiedene dynamische Lichtstimulationsregime unter Verwendung optogenetischer FGFR1- und Raf-Aktuatoren gemessen haben. LITOS kann alle Zellen in einer Vertiefung gleichmäßig stimulieren und ermöglicht flexible zeitliche Stimulationsschemata. Die Erschwinglichkeit und Benutzerfreundlichkeit von LITOS zielt darauf ab, die Optogenetik in jedem Labor zu demokratisieren.

Während die Optogenetik zunächst in der Neurobiologie1 eingesetzt wurde, wird sie heute häufig zur Steuerung einer Vielzahl zellbiologischer Prozesse mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung2 eingesetzt. Möglich wurde dies durch die Entdeckung einer Reihe lichtempfindlicher Proteindomänen, die so konstruiert wurden, dass sie Aktoren zur Steuerung nahezu aller zellbiologischen Prozesse2 bilden. Die Präzision der Optogenetik zur Störung zellulärer Systeme kann zu einem tieferen Verständnis ihrer dynamischen Regulation führen3. Optogenetische Experimente erfordern jedoch auch entsprechende optische Stimulationshardware.

Ein klassischer optogenetischer Versuchsaufbau verwendet automatisierte Lichtmikroskope, um Zellen zu stimulieren, die optogenetische Aktoren exprimieren, und jede gewünschte Zellleistung aufzuzeichnen. In Kombination mit spektral kompatiblen Biosensoren in einem Fluoreszenzmikroskop kann dieser Aufbau sowohl den zellulären Input mithilfe des optogenetischen Aktors steuern als auch die Output-Dynamik mithilfe des Biosensors aufzeichnen4. Dies hat sich als sehr wirkungsvoller Ansatz zur Untersuchung der Signaldynamik erwiesen5,6,7. Leider begrenzt das Sichtfeld des Linsensystems des Mikroskops die Anzahl der Zellen, die die Lichtstimulation erhalten. Daher können Mikroskope nicht genügend Zellen stimulieren, um die zelluläre Produktion mit biochemischen Methoden zu messen. Darüber hinaus ist die Anzahl unterschiedlicher Eingabestimulationsmuster, die parallel induziert werden können, begrenzt. Schließlich könnte eine langfristige optogenetische Kontrolle von Zellen über einen Zeitraum von mehreren Tagen unpraktisch oder zu teuer sein, insbesondere in Mikroskopieeinrichtungen.

Durch die Verwendung einer speziellen Beleuchtungsquelle zur Trennung der Stimulation vom Bildgebungsprozess werden einige dieser Einschränkungen umgangen. In einem Inkubator montierte LED-Streifen können verwendet werden, um einen optogenetischen Aktor in einer großen Anzahl von Zellen zu stimulieren, was die Möglichkeit eröffnet, zelluläre Outputs mithilfe biochemischer Methoden wie Western Blot, Proteomik oder Transkriptomik zu messen8.

Fortgeschrittenere Setups kombinieren Mikrocontroller und Lichtquellen, um einzelne Wells von Multiwellplatten gezielt zu beleuchten. Dies ermöglicht die parallele Stimulation mehrerer Wells mit unterschiedlichen Mustern von Lichteingängen, was zu einem höheren experimentellen Durchsatz führt. Es wurde eine Reihe von Hardwarelösungen entwickelt, die LEDs als Beleuchtungsquellen nutzen9,10,11,12. Diese Open-Source-Geräte sind relativ günstig, erfordern jedoch Programmierkenntnisse und stützen sich möglicherweise auf Fertigungskenntnisse, die in den meisten Labors nicht vorhanden sind. Kürzlich sind einige kommerzielle Produkte (z. B. LUMOS von AXION Biosystems) auf den Markt gekommen, ihre Kosten sind jedoch nach wie vor hoch. In der optogenetischen Gemeinschaft fehlt immer noch ein billiges, einfach zu montierendes und benutzerfreundliches Gerät, das experimentelle Flexibilität bietet.

Hier präsentieren wir ein neues LED-Beleuchtungstool für optogenetische Stimulation (LITOS), um die Optogenetik in jedem zellbiologischen Labor zu demokratisieren. LITOS ermöglicht die dynamische Lichtstimulation großer Zellpopulationen mit hohem Durchsatz in verschiedenen Multiwell-Plattenformaten, Petrischalen oder Zellkulturflaschen. Seine Benutzerfreundlichkeit ermöglicht es Benutzern mit geringen technischen Kenntnissen und ohne Programmierkenntnisse, das Gerät einfach zu verwenden und komplexe Beleuchtungsmuster einzurichten. Darüber hinaus lässt sich LITOS mit minimalem Werkzeugaufwand einfach zusammenbauen. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung der LITOS-Montage und dokumentieren eine benutzerfreundliche GUI-Lösung zur Konfiguration komplexer Beleuchtungsmuster. Wir haben LITOS mithilfe von Säugetierzelllinien validiert, die optogenetische Aktoren auf Basis von FGFR1 und Raf exprimieren, und den Weg der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK)/extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK) als Signalausgang unter Verwendung sowohl biochemischer als auch bildgebender Ansätze bewertet.

Um den Bedarf an komplexen Herstellungsverfahren zu minimieren, haben wir LITOS vollständig auf kommerziell erhältlichen Komponenten basiert (Abb. 1, 2a). LITOS setzt auf eine kundenspezifische Leiterplatte (PCB), die vormontiert bei einem Leiterplattenhersteller bestellt werden kann. Die Platine fungiert als Steuereinheit für eine handelsübliche RGB-LED-Matrix. Die Platine enthält einen ESP32-Mikrocontroller, der ausreichend Rechenleistung zur Steuerung der LED-Matrix und eines drahtlosen Netzwerkknotens bereitstellt (Abb. 2b). Die RGB-LED-Matrix besteht aus einem Array von 32 × 64 LEDs mit einem 3-mm-Abstand, der eine Beleuchtung mit jeder Kombination aus rotem, grünem und blauem Licht ermöglicht. Es kann Zellen beleuchten, die in Platten mit 6, 12, 24, 48 oder 96 Multiwells sowie in Petrischalen und Zellkulturflaschen kultiviert werden (Abb. 2c). Wir haben uns für dieses LED-Matrixformat mit 3-mm-Abstand entschieden, weil es perfekt zum typischen 96-Well-Plattenlayout (9 mm) passt und zu einem 2 × 2-LED-Array in der Mitte jedes Wells führt. Darüber hinaus ermöglicht die RGB-LED-Matrix dem Benutzer, die Intensität der drei Farben nach Belieben zu modulieren. Jede einzelne LED erzeugt einen Lichtkegel, der einen Bereich beleuchtet, der mit der Entfernung der Probe von der LED größer wird. Durch Vergrößerung des Abstands zwischen Probe und LED wird das Beleuchtungsfeld daher zunehmend homogener (ergänzende Abbildung S1a, b). Wir zeigen, dass die Probe einer homogenen Beleuchtung mit einer maximalen Lichtintensitätsschwankung von 25 % ausgesetzt ist, wenn sie 2 mm von den LEDs entfernt platziert wird, was bei den 96 Multiwellplatten, die wir in dieser Studie verwendet haben, der Fall ist Rand des Brunnens. Durch Erhöhen dieses Abstands wird die Homogenität der Beleuchtung weiter verbessert, jedoch auf Kosten der teilweisen Beleuchtung benachbarter Wells in einer 96-Multiwell-Platte (ergänzende Abbildung S1a, b). Obwohl dies weiterhin eine Option ist, erfordert LITOS daher keinen Lichtdiffusor zur Verbesserung der Gleichmäßigkeit der Beleuchtung in einem Schacht, wie er in ähnlichen Geräten verwendet wird9. Darüber hinaus ermöglicht die LED-Matrix des LITOS die Steuerung einzelner LEDs innerhalb einer Vertiefung einer 96-Well-Platte, um inhomogene Lichtbeleuchtungsmuster zu erzeugen, die in einigen Experimenten von Vorteil sein können (ergänzende Abbildung S1c). Durch Modulation der Intensität einzelner LEDs kann LITOS Lichtgradienten über cm-Maßstäbe hinweg erzeugen (ergänzende Abbildung S1d).

Schaltpläne der LITOS-Komponenten. LITOS besteht aus zwei Teilen: einer Leiterplatte (PCB), die als Steuereinheit fungiert, und einer handelsüblichen 32 × 64 RGB-LED-Matrix. LITOS kann mit einem Computer oder Smartphone über eine WLAN-Verbindung gesteuert werden. Die Leiterplatte steuert die 32 × 64 RGB-LED-Matrix zur Beleuchtung optogenetischer Zellen. Die dichte LED-Matrix ermöglicht die Beleuchtung verschiedener Zellkulturschalen und Wellplatten. Mit einem Bildschirm und vier Tasten lässt sich LITOS direkt steuern und kann Meldungen über die Durchführung eines Experiments oder über Aktionen, die ein Eingreifen des Benutzers erfordern, anzeigen.

LITOS kann flexible Lichtstimulationsmuster erzeugen. (a) Nach dem Zusammenbau besteht LITOS aus der Leiterplatte und der 32 × 64-LED-Matrix. Hier wird LITOS verwendet, um eine 8 × 12-Matrix aus 4 LEDs pro Well zu erzeugen, um jedes Well einer 96-Well-Platte zu stimulieren. (b) Die Platine bietet alles, was zum Betrieb der Matrix benötigt wird: den Mikrocontroller mit WLAN-Modul, die Anschlüsse zur LED-Matrix, ein Display und vier Tasten für benutzerdefinierte Aktionen (z. B. Markieren eines Plattenumrisses, Experimentstart und Experimentende) . (c) Beispiele für LITOS-Anwendungen mit unterschiedlichen Teller- oder Schalenformaten. Linkes Feld: gleichzeitige Stimulation von zwei 96-Well-Platten unter Verwendung einer optionalen Plexiglasmaske zur Plattenausrichtung. Oben rechts: zwei 100-mm-Petrischalen. Unten links: Wechselndes Beleuchtungsmuster für eine einzelne 96-Well-Platte. Unten rechts: Stimulationsmuster für eine 6-Well-Platte.

Das PCB-Modul und die RGB-LED-Matrix werden mit einem Flachbandkabel und einem Stromkabel verbunden. Dieser einfache Montagevorgang erfordert kein Löten. Die Schaltpläne von LITOS sowie für ein optionales 3D-gedrucktes Gehäuse (Ergänzende Abbildung S2) finden Sie auf unserer GitHub-Seite (https://github.com/pertzlab/LITOS).

Um die Ausrichtung der Platten in dunklen Umgebungen zu erleichtern, haben wir drei Lösungen implementiert: (i) Verwendung von LITOS zur Anzeige eines Referenzumrisses der gewünschten Wellplatte auf der LED-Matrix, der direkt über eine Taste auf der Leiterplatte aktiviert werden kann (ergänzende Abbildung S3a). ); (ii) Ausrichten der Platte an der oberen linken Ecke der LED-Matrix (ergänzende Abbildung S3b) und (iii) Verwenden einer Maske, die die Platte auf der LED-Matrix positioniert (letztere kann durch 3D-Druck oder CNC-Fräsen hergestellt werden) ( Ergänzende Abbildung S3c). Mit einer solchen Maske können auch zwei Multiwellplatten gleichzeitig auf einem LITOS-Gerät platziert und stimuliert werden.

Die Gesamtkosten von LITOS, bestehend aus einer von einem Leiterplattenhersteller bestückten kundenspezifischen Leiterplatte und einer handelsüblichen LED-Matrix, belaufen sich auf etwa 200,00 USD. Dieser niedrige Preis des Geräts ermöglicht eine einfache Erweiterung der Experimente durch die Bestellung weiterer Einheiten. Bei Bestellung mehrerer Geräte kann der Stückpreis noch weiter gesenkt werden.

Ebenso wie die Hardware wurde auch die Software von LITOS auf Benutzerfreundlichkeit ausgelegt. Die auf der Steuereinheit vorhandene Software verwendet benutzerdefinierte Beleuchtungsschemata, die dann zur Steuerung der LED-Matrix verarbeitet werden (Abb. 3a–c).

Allgemeiner Benutzerworkflow von LITOS. (a) Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs zur Erzeugung spezifischer Beleuchtungsmuster. Eine CSV-Datei mit dem gewünschten Muster kann über einen Webbrowser auf das von der Steuereinheit gehostete „Configuration Interface“ hochgeladen werden. Die Steuereinheit steuert dann die LED-Matrix entsprechend dem hochgeladenen Beleuchtungsmuster. (b) Beispiel für eine CSV-Datei, die für ein bestimmtes Beleuchtungsmuster verwendet wird. Hier sind die Vertiefungen A01 und B01 so programmiert, dass sie alle 5 Minuten mit einem 3-s-Impuls blauen Lichts beleuchtet werden. Die Vertiefungen C01 und D01 werden nach dem gleichen Muster programmiert, jedoch mit einer Verzögerung von 30 Minuten. In beiden Fällen hat das Experiment eine Gesamtdauer von 1 Stunde. (c) Die von LITOS gehostete Benutzeroberfläche wird zur Übertragung der Beleuchtungsmuster verwendet, die anschließend für optogenetische Experimente geladen werden können.

Für die Einrichtung gewünschter Beleuchtungsmuster sind keine Programmierkenntnisse erforderlich. Um zu definieren, welche LEDs zu welcher bestimmten Zeit, für welche bestimmte Dauer und in welcher bestimmten Farbe eingeschaltet werden sollen, erstellt der Benutzer eine Datei mit durch Kommas getrennten Werten (CSV). Dies kann mithilfe von Tabellenkalkulationsprogrammen wie Google Sheets, Microsoft Excel oder LibreOffice Calc erfolgen. In der CSV-Datei beschreibt jede Zeile einen Beleuchtungsbefehl (Abb. 3b). Jede Spalte zeigt verschiedene Parameter des Stimulationsprogramms an: zu aktivierende LEDs, Startzeitpunkt der Beleuchtung, Beleuchtungsdauer, Farbe und Intensität der aktiven LEDs. Um einen Teil der begrenzten Ressourcen des Mikrocontrollers für andere Softwareprozesse freizugeben, haben wir die minimale Impulsdauer auf 1 s begrenzt. Andere Spalten ermöglichen die Erzeugung von Schleifen, um ein Stimulationsmuster mehrmals zu wiederholen (z. B. 3 Stunden lang alle 10 Minuten beleuchtet). Damit der Benutzer nicht immer einzelne LEDs definieren muss, haben wir Schlüsselwörter entwickelt, um vordefinierte Bereiche zu beleuchten: (i) Well (z. B. „A02“/ „A2“ für Well A02); (ii) Spalte und Zeile (z. B. „D“ für die gesamte Zeile D); (iii) ganze Multiwellplatte (Platte); (iv) Gesamtmatrix (Ganz); (v) Kreis und Rechtecke (Rec_start_end). Die Software von LITOS übersetzt diese Schlüsselwörter in die entsprechenden LED-Positionen der Matrix. Für noch mehr Flexibilität besteht auch die Möglichkeit, einzelne LEDs anzusteuern, was beispielsweise die Erzeugung von Intensitäts- und/oder Farbverläufen oder die Anzeige von Text ermöglicht.

Darüber hinaus können in solchen CSV-Dateien benutzerdefinierte Nachrichten mit Countdowns programmiert werden, die auf der Steuereinheit angezeigt werden. Dies kann dem Benutzer bei zusätzlichen Aufgaben während des optogenetischen Experiments helfen, beispielsweise beim Pipettieren eines Reagenzes in eine bestimmte Vertiefung. Da diese Aufgaben zeitkritisch sein können, unterstützt ein kleiner Piezo-Summer den Benutzer neben den visuellen mit zusätzlichen akustischen Signalen.

Die CSV-Datei des Beleuchtungsmusters wird dann über dessen WLAN-Modul an die Steuereinheit übertragen. Auf der Steuereinheit wird eine Java-Script-basierte Konfigurationsschnittstelle (Abb. 3c) gehostet, um Beleuchtungsmuster hochzuladen und zu verwalten, Einstellungen zu ändern und LITOS für ein Experiment vorzubereiten. Im internen Speicher der Steuereinheit können mehrere Beleuchtungsmuster gespeichert werden, sodass Stimulationsmuster wiederverwendet werden können, ohne dass sie erneut hochgeladen werden müssen. Der Zugriff auf die Konfigurationsoberfläche der Steuereinheit kann entweder über einen von LITOS erstellten WLAN-Zugangspunkt oder über das lokale WLAN-Netzwerk erfolgen. Auf dem internen Display werden die für die Verbindung benötigten Informationen wie die IP-Adresse von LITOS oder der Name des erstellten WLAN-Zugangspunkts angezeigt. Bei bestehender Verbindung kann der Benutzer über einen Webbrowser auf jedem Computer oder Smartphone unabhängig von der Plattform auf die Konfigurationsoberfläche zugreifen.

Sobald ein Beleuchtungsmuster übertragen und ausgewählt wurde, ist LITOS bereit, das Experiment durchzuführen. Mit den LITOS-Tasten kann der Benutzer durch das Menü navigieren, das Experiment starten oder abbrechen oder mit einem Umriss auf der RGB-Matrix angeben, wo die Multiwellplatte platziert werden soll. Der aktuelle Fortschritt eines Beleuchtungsprogramms am LITOS kann direkt auf dem Display der Steuereinheit verfolgt werden. Der Zusatzfilm S1 zeigt, wie die LED-Matrix ein Stimulationsmuster anwendet, bei dem jede Spalte einer 96-Well-Platte nacheinander beleuchtet wird.

Bei ersten Experimenten stellten wir fest, dass die LED-Matrix Wärme entwickelte, die möglicherweise schädlich für die Zellgesundheit sein könnte. Wir haben festgestellt, dass sich die LED-Matrix auch im Ruhezustand erwärmt, wenn keine Lichtstimulation erfolgt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine Schaltung mit N- und P-Metalloxid-Halbleiter-Feldeffekttransistoren (MOSFETs) in die Steuereinheit von LITOS integriert, um nur dann elektrischen Strom an die Matrix zu liefern, wenn ein Beleuchtungsprozess erforderlich ist. Dies reduzierte die bei sich wiederholenden Stimulationsmustern beobachtete Wärmeentwicklung. Anschließend bewerteten wir die Änderung der Mediumstemperatur aufgrund der LITOS-Beleuchtung, indem wir die Mediumstemperatur nach verschiedenen Stimulationsmustern maßen. Wie erwartet zeigen unsere Messungen, dass eine längere und häufigere Lichtstimulation zu einem höheren Temperaturanstieg führte, der nach etwa einer Stunde ein Plateau erreichte (Ergänzende Abbildung S4). Die in diesem Artikel gezeigten Experimente erforderten jedoch nie Lichtstimulationsschemata, die genug Wärme erzeugen würden, um die Zellgesundheit zu beeinträchtigen. Für den Fall, dass Experimente eine sehr lange, anhaltende Lichtzufuhr erfordern, kann das Hinzufügen kleiner passiver Kühlkörper dazu beitragen, die Überhitzung zu reduzieren. Ein anderer Ansatz besteht darin, das optogenetische Modul mit einem niedrigen koff zu konstruieren, um anhaltende lichtabhängige Wechselwirkungen hervorzurufen. Beispielsweise können im iLID-System (Improved Light Inducible Dimer) die Affinitäten und Lebensdauern der lichtabhängigen Wechselwirkung durch verschiedene Mutationen manipuliert werden13.

LITOS eignet sich für ein breites Spektrum optogenetischer Anwendungen und Modellsysteme. Um die Flexibilität und Vielseitigkeit von LITOS zu demonstrieren, führten wir optogenetische Experimente durch, um den MAPK/ERK-Signalweg zu untersuchen. Das MAPK-Netzwerk ist in der Lage, eine Vielzahl extrazellulärer und intrazellulärer Hinweise zu entschlüsseln, sie in spezifische Schicksalsentscheidungen umzuwandeln, und spielt sowohl in der Physiologie als auch in der Pathologie eine zentrale Rolle14. Aus diesem Grund wurden mehrere optogenetische Aktoren und fluoreszierende Biosensoren entwickelt, um verschiedene Signalknoten dieses Signalwegs sowohl zu steuern als auch zu messen, was ihn zu einem idealen Modellsystem zur Präsentation von LITOS macht.

Wir verwendeten Maus-NIH3T3-Fibroblasten und MCF10A-Brustepithelzelllinien, die so konstruiert wurden, dass sie einen genetisch kodierten Schaltkreis stabil exprimieren, der aus einem optogenetischen Aktuator zur Aktivierung verschiedener Knoten im MAPK-Netzwerk und einem fluoreszierenden Biosensor zur Aufzeichnung der Dynamik der ERK-Signalausgabe besteht. Dieser Schaltkreis besteht aus einem optogenetischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (optoFGFR), der aus einer myristoylierten intrazellulären Domäne des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors 1 besteht, die mit der lichtempfindlichen Domäne CRY2 fusioniert ist, die bei Stimulation mit blauem Licht multimerisiert, autophosphoryliert und den MAPK-Signalweg aktiviert4 . Die ERK-Signalausgabe kann dann mit einem ERK-Kinase-Translokationsreporter (KTR) gemessen werden, der die ERK-Aktivität mit Einzelzellauflösung meldet15. Um spektral mit der optogenetischen Aktivierung kompatibel zu sein, wird ERK-KTR mit einem rot fluoreszierenden mRuby2-Protein fusioniert, das angeregt werden kann, ohne optoFGFR zu aktivieren. Darüber hinaus exprimieren beide Zelllinien stabil einen Histon-H2B-Kernmarker, der mit dem dunkelrot fluoreszierenden Protein miRFP703 (H2B-miRFP703) fusioniert ist. Ein Schema dieses genetischen Schaltkreises ist in Abb. 4a dargestellt. Anschließend verwendeten wir einen Computer-Vision-Ansatz, um den ERK-Aktivierungsstatus für jede Zelle abzuleiten (Abb. 4b). Zu diesem Zweck wurden Kerne mithilfe des H2B-miRFP703-Kanals automatisch segmentiert und zur Ableitung einer Kernmaske und einer zytosolischen Ringmaske um den Kern herum verwendet. Anschließend wird ein Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensitäten des ERK-KTR-mRuby2-Kanals unter Verwendung der Zytosol- und Kernmasken als Proxy für die ERK-Aktivität (C/N-Verhältnis) berechnet16.

LITOS bei der Untersuchung der Signaldynamik des MAPK-Signalwegs. (a) Bei der Stimulation von optoFGFR wird der MAPK-Weg aktiviert, was zur Phosphorylierung und anschließenden Aktivierung von ERK führt. Aktives ERK phosphoryliert ERK-KTR und führt zu dessen reversibler Translokation in das Zytosol. (b) Computer-Vision-Pipeline für die Bildanalyse. Die Kernsegmentierung von NIH3T3-Zellen (rot), basierend auf dem Kernmarker H2B, und seine ringförmige Ausdehnung (blau) werden verwendet, um das Verhältnis zwischen Zytosol und Kern (C/N) von ERK-KTR zu messen. Ein hohes C/N-Verhältnis entspricht einer hohen ERK-Aktivität. (c) Die obere Reihe stellt das farbcodierte ERK-KTR-C/N-Verhältnis aller NIH3T3-Zellen in Vertiefungen mit 6,38 mm Durchmesser (96-Well-Platte) dar. Die beiden unteren Reihen stellen ein Beispiel eines FOV in voller Auflösung dar, aus dem das größere Bild oben besteht, wobei H2B-miRFP703 und ERK-KTR-mRuby2 in invertierten Graustufen dargestellt sind. (d) MCF10A-Zellen, die ERK-KTR exprimieren, wurden mit einem 10 s langen Lichtimpuls stimuliert, mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und ihre ERK-Aktivität wurde wie in (b) gezeigt quantifiziert. Die ERK-Aktivität wurde dann mit einem Western Blot gegen phosphoryliertes und Gesamt-ERK aus denselben Zellen verglichen (unten). Native, nicht beschnittene Western Blots sind in der ergänzenden Abbildung S4 verfügbar.

Das erste Merkmal von LITOS, das wir bewertet haben, war die Fähigkeit des LED-Arrays, alle Zellen innerhalb einer Vertiefung homogen zu stimulieren. Diese Funktion ist für bevölkerungsweite Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Zu diesem Zweck haben wir 96-Well-Platten stimuliert, in denen jedes Well durch vier LEDs beleuchtet wird, und das ERK-KTR-C/N in allen Zellen eines Wells gemessen, indem wir ein großes Mosaikbild jedes gesamten Wells aufgenommen haben. Die Anzeige der ERK-KTR-C/N-Verhältniswerte jeder einzelnen Zelle in ganzen Vertiefungen ergab, dass die vier LEDs einer einzelnen Vertiefung eine robuste und homogene optogenetische Aktivierung des MAPK-Signalwegs induzierten (Abb. 4c). Da die verschiedenen Experimente in benachbarten Vertiefungen durchgeführt wurden, zeigt dies auch, dass die geringe Menge an übertretendem Licht nicht zur Aktivierung der ERK-Aktivität führt.

Anschließend testeten wir die Fähigkeit von LITOS, eine robuste ERK-Aktivierung mit einer bevölkerungsdurchschnittlichen biochemischen Methode zu erzeugen, indem wir eine Western-Blot-Analyse mit einem PhosphoERK-Antikörper (pERK) verwendeten. Um ausreichend Proteinlysat zu produzieren, haben wir MCF10A-Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät, was etwa 250 µg Proteinlysat pro Vertiefung ergab. Die Beleuchtung eines gesamten Wells einer 6-Well-Platte erforderte das Einschalten von 112 LEDs (Abb. 2c, unteres rechtes Feld). Wir stimulierten die optoFGFR-exprimierenden Zellen mit einem 10-sekündigen blauen Lichtimpuls mit LITOS und fixierten die Zellen mit Paraformaldehyd zu verschiedenen Zeitpunkten im Abstand von 3 Minuten. Um die mit Western Blot beobachtete ERK-Aktivierungsdynamik mit der des ERK-KTR-Biosensors zu vergleichen, haben wir das ERK-KTR-C/N-Verhältnis in allen Vertiefungen vor der Proteinextraktion gemessen. Um die lokale Variabilität der ERK-KTR-C/N-Verhältnisse einzelner Zellen zu mitteln, haben wir jede Vertiefung mit 16 FOVs beprobt und ihren Populationsdurchschnitt berechnet. Die Western-Blot-Messung von endogenem pERK folgt eng der Messung der ERK-Kinase-Aktivität mithilfe des ERK-KTR-Biosensors. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen5,16 zeigten sowohl pERK- als auch ERK-KTR-Signale einen steilen Anstieg der ERK-Aktivität direkt nach der Lichtstimulation, gefolgt von einer langsameren Anpassung, die innerhalb von angemessen 20 Minuten zu ERK-Aktivitätsniveaus vor der Stimulation führte. Das ERK-KTR-Signal (Peak nach 6 Minuten) war im Vergleich zum pERK-Signal (Peak nach 3 Minuten) leicht verzögert (Abb. 4d). Dies spiegelt möglicherweise die Zeit wider, die ERK für die Translokation in den Zellkern benötigt, und/oder die Zeit, die der ERK-KTR-Biosensor für die Translokation in das Zytosol benötigt.

Diese Experimente zeigen, dass LITOS alle Zellen in einer großen Vertiefung gleichmäßig und zuverlässig aktivieren kann und dass es die große Anzahl von Zellen stimulieren kann, die für den Western Blot erforderlich sind. Dadurch ist LITOS auch mit anderen Populationsdurchschnittsmessungen (z. B. Transkriptomik oder (Phospho)Proteomik) kompatibel.

Um das Potenzial der Optogenetik bei der Steuerung dynamischer biologischer Prozesse voll auszuschöpfen, sollte LITOS in der Lage sein, verschiedene optogenetische Aktoren zu aktivieren und über eine hohe Flexibilität bei der Erstellung komplexer Beleuchtungsmuster zu verfügen. Wir haben daher eine Reihe zusätzlicher Experimente durchgeführt, um zu zeigen, dass LITOS diese Anforderungen erfüllt. In allen folgenden Experimenten haben wir LITOS so programmiert, dass die Lichteingänge zu bestimmten Zeiten automatisch auf verschiedene Wells angewendet werden, sodass die Zellen in einer 96-Well-Platte am Ende des Experiments gleichzeitig fixiert werden können. Nach der Zellfixierung haben wir alle Vertiefungen der Platten mithilfe automatisierter Mikroskopie abgebildet. Anschließend nutzten wir unsere automatisierte Bildanalyse-Pipeline, um eine mittlere ERK-Aktivität pro Well zu berechnen. Beachten Sie, dass die Durchführung solcher Experimente mit Pipettieren von Wachstumsfaktoren zur zeitaufgelösten Aktivierung des MAPK-Netzwerks sehr mühsam wäre.

Wir haben zunächst untersucht, ob LITOS auch in der Lage ist, einen optogenetischen Aktor zu stimulieren, der einen anderen Aktivierungsmechanismus als optoFGFR verwendet. Im Gegensatz zu optoFGFR, das auf der Multimerisierung eines lichtempfindlichen Membranrezeptors basiert, beinhaltet optoRaf17 die lichtabhängige Rekrutierung einer katalytischen c-Raf-Domäne an der Membran über ein CRY2-System. Um zu beurteilen, ob LITOS auch optoRaf stimulieren kann, haben wir Lichteingänge unterschiedlicher Dauer untersucht und sie mit der optoFGFR-Stimulation verglichen. Wir beobachteten, dass ein 30-s-Lichtimpuls im optoRaf im Vergleich zum optoFGFR-System eine höhere ERK-Amplitude induzierte (Abb. 5a). Dies zeigte sich auch zu späteren Zeitpunkten. Als Reaktion auf den zunehmenden Lichteintrag führte optoFGFR zu einem Übergang von der transienten zur anhaltenden ERK-Dynamik, wie zuvor beobachtet5, während optoRaf stets eine adaptive ERK-Dynamik aufwies. Die unterschiedliche ERK-Dynamik, die durch optoFGFR- und optoRaf-Eingänge induziert wird, könnte entweder unterschiedliche Betätigungsmechanismen widerspiegeln oder einen Unterschied in der Fähigkeit der beiden Aktoren, ERK auf verschiedenen Ebenen innerhalb des MAPK-Netzwerks zu aktivieren: optoFGFR löst die Aktivierung eines vollständigen MAPK-Netzwerks nachgeschaltet aus Rezeptor, wohingegen optoRaf nur die Aktivierung eines isolierten MEK/ERK-Netzwerks auslöst. Dies veranschaulicht, wie LITOS zur Untersuchung der ERK-Dynamik verwendet werden kann, die durch verschiedene optogenetische Aktoren induziert wird.

Zeigt die Vielseitigkeit von LITOS bei der Untersuchung der MAPK-Signaldynamik. (a) ERK-Reaktion auf optoFGFR- oder optoRaf-Lichteingänge zu verschiedenen Zeitpunkten. (b) Kleines Arzneimittelscreening auf NIH3T3, das optoFGFR exprimiert, durchgeführt in einer einzelnen 96-Well-Platte unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des Raf-Inhibitors RAF709, des ERK-Inhibitors SCH772984 und des MEK-Inhibitors U0126. (c) ERK-Aktivitätsdynamik, gemessen nach einem einzelnen 2 s langen blauen Lichtimpuls mit LITOS, gemessen mit einer zeitlichen Auflösung von 1 Minute. (d) Vergleich der mit LITOS erzeugten pulsierenden und anhaltenden ERK-Aktivitätsdynamik. (a–d) Die ERK-Aktivität wurde als ERK-KTR C/N gemessen. Boxplots stellen den Median (Mittellinie), das 2. und 3. Quartil (Boxen) und den 1,5-Interquartilbereich (Whisker) von Einzelzellen-ERK-KTR-C/N-Messungen dar. Liniendiagramme stellen den Durchschnitt (Linie) und den Standardfehler des mittleren Intervalls (Fehlerbalken) von Einzelzellen-ERK-KTR-C/N-Messungen dar.

Anschließend haben wir das Potenzial von LITOS zur Durchführung eines Drogenscreenings mit ERK-Dynamik als Anzeige weiter bewertet (Abb. 5b). Als Machbarkeitsnachweis haben wir drei Medikamente getestet, die den MAPK-Signalweg hemmen: den Raf-Inhibitor RAF709, den MEK-Inhibitor U0126 und den ERK-Inhibitor SCH772984. Wir haben jeden Inhibitor in zwei Konzentrationen angewendet. Wir stimulierten optoFGFR-Zellen mit einem einzelnen 10-s-Blaulichtimpuls in Gegenwart der Inhibitoren und maßen die ERK-Aktivität zu 12 verschiedenen Zeitpunkten mit einer Zeitauflösung von 2 Minuten. Alle drei Medikamente führten zu einer dosisabhängigen Verringerung der ERK-Aktivität. Der Höhepunkt der ERK-Aktivität wurde bei den beiden höchsten Konzentrationen von RAF709 und U0126 deutlich reduziert oder bei der höchsten Konzentration von SCH772984 sogar aufgehoben (Abb. 5b). Dies zeigt, dass LITOS geeignet ist, mit relativ geringem Aufwand nach Störungen der Signaldynamik zu suchen.

Als nächstes bewerteten wir das Potenzial von LITOS zur Untersuchung der ERK-Dynamik, die eine hohe zeitliche Auflösung erfordert. Zu diesem Zweck stimulierten wir optoFGFR-Zellen mit einem einzelnen 2-s-Blaulichtimpuls und fixierten die Zellen mit einer Zeitauflösung von 1 Minute. Dadurch wurden hochaufgelöste Details der ERK-Aktivitätsdynamik erfasst, beispielsweise die steile Phase der ERK-Aktivierung, gefolgt von einer langsameren Anpassungsphase (Abb. 5c). Dieses Ergebnis unterstreicht die Fähigkeit von LITOS, schnelle Signalereignisse zu untersuchen.

Die bisher dokumentierten Experimente basieren auf einzelnen Blaulichtimpulsen. Es ist jedoch bekannt, dass unterschiedliche Signalnetzwerke unterschiedliche dynamische Signalmuster kodieren, die aus vorübergehenden, anhaltenden, oszillierenden oder pulsierenden Signaldynamiken bestehen können18. Die Reproduktion dieser komplexen Dynamikprofile mithilfe eines Ansatzes der synthetischen Biologie könnte wichtige Einblicke in das Netzwerk liefern, das diese Dynamik prägt. Daher haben wir die Fähigkeit von LITOS bewertet, komplexere Lichteingabemuster zu erzeugen, um spezifische synthetische ERK-Dynamikmuster hervorzurufen. Zu diesem Zweck haben wir LITOS so programmiert, dass es optoFGFR-Zellen mit 10 Sekunden langen Lichtimpulsen mit hoher (alle 2 Minuten) oder niedriger Frequenz (alle 20 Minuten) insgesamt 84 Minuten lang stimuliert. Wir fanden heraus, dass hochfrequente Lichtimpulse eine anhaltende ERK-Dynamik hervorrufen (Abb. 5d). Dies steht im Einklang mit der Feststellung, dass ein einzelner blauer Lichtimpuls optoFGFR für etwa 5–10 Minuten einschaltet5, sodass ERK nicht deaktiviert werden kann, wenn optoFGFR alle 2 Minuten reaktiviert wird. Im Gegensatz dazu lösten niederfrequente Lichtimpulse aufeinanderfolgende, diskrete ERK-Impulse aus, die alle eine Anpassung an die Grundlinie zeigten, bis ein neuer Lichteintrag angewendet wurde. Dies zeigt, wie LITOS verwendet werden kann, um benutzerdefinierte synthetische ERK-Dynamik präzise abzustimmen. Dieses Experiment erforderte die Anwendung verschiedener Lichtstimulationsschemata auf 86 Vertiefungen der Wellplatte (Stimulationsschemata in den ergänzenden Abbildungen S6 und S7), was die Komplexität der Experimente verdeutlicht, die LITOS bewältigen kann. LITOS lieferte die Zeitauflösung, um eine vorübergehende Abnahme der ERK-KTR-Phosphorylierung zu erfassen (Abb. 5b, d), von der wir zuvor gezeigt haben, dass sie auf die Aktivierung von optoFGFR-Calcineurin zurückzuführen ist5. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass LITOS ein hochflexibles optogenetisches Gerät ist, das die Durchführung komplexer Experimente zur Untersuchung der Dynamik des MAPK-Signalwegs ermöglicht.

Wir präsentieren LITOS, ein benutzerfreundliches, kostengünstiges, einfach zu montierendes und robustes LED-Matrix-Tool mit dem Ziel, inkubatorbasierte optogenetische Stimulationsexperimente zu demokratisieren. LITOS besteht aus Teilen, die einfach online gekauft oder beim Hersteller bestellt werden können. Hier und in einem GitHub-Repository (https://github.com/pertzlab/LITOS) stellen wir Anweisungen zum Zusammenstellen und Verwenden von LITOS bereit. Wir dokumentieren auch eine dedizierte Softwarelösung zur Steuerung von LITOS. Wir vergleichen LITOS, indem wir die Dynamik des MAPK-Signalwegs untersuchen, der durch verschiedene optogenetische Aktoren manipuliert und mit einem fluoreszierenden Biosensor gemessen werden kann. Dies zeigte, dass die LED-Dichte in LITOS ausreicht, um alle in Wellplatten kultivierten Zellen gleichmäßig zu stimulieren (Abb. 4c), was die Durchführung zuverlässiger Populationsdurchschnittsmessungen mit biochemischen Methoden wie Western Blot ermöglicht (Abb. 4d). Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass LITOS mit zwei verschiedenen optogenetischen Aktoren kompatibel ist (Abb. 5a), den notwendigen Durchsatz für die Durchführung kleiner Arzneimitteltests bietet (Abb. 5b), Messungen mit hoher zeitlicher Auflösung ermöglicht (Abb. 5c) und die Anwendung von ermöglicht komplexe Lichtstimulationsschemata (Abb. 5d). Diese Funktionen erfüllen die Anforderungen des schnell wachsenden Gebiets der Optogenetik und ihrer Anwendung bei der Untersuchung dynamischer Prozesse.

Die Bedeutung der dynamischen Regulierung biologischer Prozesse, einschließlich der Signaldynamik, wurde in den letzten Jahren zunehmend erkannt18. Die in Epithelkollektiven beobachtete pulsierende Dynamik der ERK-Aktivität ist eines der auffälligsten Beispiele16,17,19,20,21,22. Hier wurde gezeigt, dass die Frequenz von ERK-Impulsen mit konstanter Amplitude und Dauer verschiedene Schicksalsentscheidungen wie Zelltod, Überleben, Proliferation und Migration steuert16,19,21,22. Fluoreszierende Biosensoren haben es uns ermöglicht, diese Signalereignisse in angemessenen räumlichen und zeitlichen Maßstäben zu visualisieren. Die Optogenetik ermöglicht es uns nun auch, diese biologischen Prozesse auf diesen biologisch relevanten Zeit- und Raumskalen auf nicht-invasive Weise zu steuern. Wir hatten zuvor gezeigt, dass die Anwendung frequenzmodulierter optoFGFR- oder optoRaf-Eingaben frequenzmodulierte ERK-Dynamikregime hervorrufen kann, in denen alle Zellen in der Population synchron reagieren16. Dies steht im Gegensatz zur häufig verwendeten, anhaltenden Massenanwendung von Wachstumsfaktoren, die oft zu heterogenen, unsynchronisierten Signalverhalten führt16,19,23. Hier zeigt LITOS erneut, dass dies geschieht, wenn bestimmte lichtvermittelte optoFGFR-Eingaben angewendet werden. Die Anwendung eines lichtvermittelten optoFGFR-Eingangs mit LITOS führte zu einer populationshomogenen steilen ERK-Aktivierung, gefolgt von einer Anpassung, die dazu führte, dass alle Zellen einer Population einen identischen ERK-Impuls erlebten (Abb. 4c). Mehrere Lichtimpulse mit niedriger Frequenz könnten zu bevölkerungssynchronen diskreten ERK-Impulsen führen (Abb. 5d). Im Gegensatz dazu konnte eine anhaltende ERK-Aktivität hervorgerufen werden, wenn diese Lichtimpulse mit hoher Frequenz angewendet wurden, was keine Inaktivierung von optoFGFR ermöglichte (Abb. 5d). Wir gehen davon aus, dass diese Merkmale von LITOS und ähnlichen Geräten die Zuverlässigkeit biochemischer Bevölkerungsdurchschnittsmessungen wie Western Blot, Transkriptomik oder (Phospho-)Proteomik erhöhen werden. Hier wird die Fähigkeit, eine bevölkerungssynchrone ERK-Dynamik zu induzieren, zuverlässige Bevölkerungsdurchschnittsmessungen mithilfe biochemischer Ansätze ermöglichen. Dies steht im Gegensatz zu Massenwachstumsfaktor-Stimulationsexperimenten, bei denen möglicherweise heterogene Signalzustände gemittelt werden. Wir gehen beispielsweise davon aus, dass zeitlich hochaufgelöste Phosphoproteome eines ERK-Impulses, der durch einen transienten optoFGFR-Eingang hervorgerufen wird, die Fluktuationen von Phosphosites in biologisch relevanten Zeitskalen abbilden und so ein besseres Verständnis der Rezeptortyrosinkinase-MAPK-Signalisierung ermöglichen könnten. Alternativ könnte die Fähigkeit, gewünschte synthetische ERK-Dynamiken hervorzurufen, die spezifische Schicksalsentscheidungen (z. B. Überleben, Proliferation, Differenzierung) herbeiführen können, in Verbindung mit Omics-Ansätzen (z. B. Transkriptomik, (Phospho)Proteomik) neue Erkenntnisse über die ERK-Dynamik liefern in Schicksalsentscheidungen entschlüsselt. Durch die Nutzung des ständig wachsenden Repertoires an optogenetischen Aktoren und Biosensoren stellen wir uns vor, dass eine ähnliche experimentelle Logik auf andere Signalsysteme angewendet werden kann.

Ein weiteres wichtiges Potenzial von LITOS liegt in der Untersuchung biologischer Prozesse, die über mehrere Tage hinweg ablaufen und für die optogenetische Stimulation spezielle Mikroskope für große Zeiträume erfordern würden. Dies wird durch eine separate Studie veranschaulicht, in der wir LITOS zur optogenetischen Kontrolle der ERK-Signalisierung bei der 3D-Brustacini-Morphogenese verwendeten, einem Entwicklungsprozess, der sich über einen Zeitraum von zwei Wochen abspielt24. Wir konzentrierten uns auf eine ERK-abhängige Entwicklungsepisode, in der das Azinuslumen durch Überleben der äußeren Zellen und Apoptose der inneren Zellmasse in einem Prozess gebildet wird, der etwa eine Woche dauert. Wir fanden heraus, dass die ERK-Pulsfrequenz in den äußeren Zellen höher war als in den inneren Zellen, und stellten die Hypothese auf, dass die ERK-Pulsfrequenz daher das Überleben im Vergleich zum Schicksal der Apoptose bestimmt. Unter Verwendung von optoFGFR- und optoRaf-Aktuatoren verwendeten wir LITOS, um verschiedene synthetische frequenzmodulierte ERK-Impulsregime hervorzurufen. Wir beobachteten, dass hochfrequente ERK-Pulsregime die Überlebensphänotypen in inneren Zellen retteten und die Bildung des Azinuslumens behinderten. Diese Ergebnisse veranschaulichen, wie LITOS morphogenetische Ereignisse steuern kann, die an mehreren Tagen in Experimenten auftreten, die in einem Gewebekultur-Inkubator durchgeführt werden. Wir gehen davon aus, dass die LITOS-vermittelte Steuerung optogenetischer Aktoren für eine Vielzahl von Anwendungen in der 3D-Biologie, einschließlich der Organoidkultur, eingesetzt werden könnte.

Das schlichte Design von LITOS macht es vielseitig und erschwinglich. Während wir unsere Studie auf CRY2-basierte Systeme beschränkten, sollte die RGB-LED-Matrix von LITOS auch die Steuerung optogenetischer Aktoren basierend auf Cryptochrom-, Dronpa- und LOV-Domänen (z. B. iLID, TULIP) ermöglichen25. Allerdings kann die Einfachheit von LITOS auch mit einigen Einschränkungen verbunden sein. Die maximale Leistungsdichte liegt im Vergleich zu anderen Open-Source- und kommerziellen Geräten am unteren Ende des Bereichs (Ergänzungstabelle S1). Wir empfehlen neuen Benutzern, zu testen, ob ihr bevorzugtes optogenetisches System durch die von LITOS erzeugte Lichtintensität aktiviert werden kann. Darüber hinaus ist LITOS spektral nicht mit Aktoren auf Phytochrombasis kompatibel, die Infrarotlicht benötigen. Wir gehen jedoch davon aus, dass in Zukunft neuartige optogenetische Aktoren verfügbar sein werden, die mit zusätzlichen Wellenlängen aktiviert werden können26 und den Anwendungsbereich von LITOS erweitern werden.

Zusammenfassend haben wir LITOS entwickelt und getestet, ein günstiges, robustes und einfach zu bedienendes LED-Beleuchtungsgerät für die Optogenetik. Wir haben gezeigt, wie LITOS bei der Untersuchung der MAPK-Signalübertragung eingesetzt werden könnte. Wir sehen ein breites Anwendungsspektrum für LITOS außerhalb des Signalisierungsbereichs. Es könnte beispielsweise zur Untersuchung der lichtgesteuerten Genexpression in Bakterien27, zur entwicklungsbiologischen Forschung bei Drosophila28 oder für die photoaktivierbare Genombearbeitung mit CRISPR-Cas929 eingesetzt werden.

Weitere Informationen zu LITOS, zur Bestellung und zum Open-Source-Code finden Sie im folgenden GitHub-Repository (https://github.com/pertzlab/LITOS).

LITOS besteht aus einer handelsüblichen RGB-LED-Matrix (P3-Indoor-LED-Anzeigemodul, 32 × 64 Pixel, mit FM6126A-IC, von Shenzhen Xuyang Technology Co. Ltd., es könnten jedoch auch Module mit anderen ICs verwendet werden) zur Zellstimulation und eine kundenspezifische Leiterplatte (PCB). Die Spitzenemissionen der LED der RGB-Matrix liegen bei 620–630 nm für Rot, 520–525 nm für Grün und 465–470 nm für Blau. Für jede LED sind 256 Intensitätsstufen einstellbar mit einer maximalen Leistungsdichte für die blaue LED von 135 ± 0,11 µW/cm2. Die Platine ist um das ESP32-WROOM-Modul (Espressif Systems Shanghai Co. Ltd.) herum aufgebaut und fungiert als Steuereinheit für die LED-Matrix. Neben den für diese Aufgabe erforderlichen Schaltkreisen sorgen ein 1,5-Zoll-OLED-Bildschirmmodul (mit SSD1351-Steuer-IC) und ein Summer (AI-1223-TWT-3 V-2-R, PUI-Audio) für zusätzliche audiovisuelle Ausgabemöglichkeiten. Für die Benutzereingabe werden Steuertasten (B3F-4050, Omron) verwendet. Die Erstprogrammierung kann über die hinzugefügte USB-Seriell-UART-Brücke (231-XS, FTDI) durchgeführt werden. Die Stromversorgung erfolgt über ein externes 5-V-Netzteil, das an einen 2,1 mm × 5,5 mm Hohlstecker auf der Platine angeschlossen ist. Da es Komponenten gibt, die eine niedrigere Spannung von 3,3 V benötigen, wurde der Platine ein linearer Spannungsregler (LM1117, Texas Instruments) hinzugefügt. Der Schaltplan von LITOS, die PCB-Layoutdateien (generiert mit KiCad 6.01, https://www.kicad.org/) und die Materialliste finden Sie in unserem GitHub-Repository (https://github.com/pertzlab/LITOS). .

Die Verbindung der Platine mit der RGB-LED-Matrix erfolgt über ein Kabel, das für die erforderliche Stromversorgung sorgt, und über ein 16-poliges Flachbandkabel, das der Signalübertragung dient. Beide Kabel werden über vorhandene Stiftleisten mit der Platine und der RGB-LED-Matrix verbunden. Abschließend wird die Platine an die externe 5-V-Stromversorgung angeschlossen. Darüber hinaus kann die Platine über ein USB-Kabel mit einem Computer verbunden werden. Dies ist erforderlich, um die Software von LITOS zunächst auf den ESP32-Mikrocontroller zu laden (sofern sie nicht vom PCB-Hersteller geladen wurde). Anschließend wird die Verbindung zu einem Computer über WLAN hergestellt.

Um das Beleuchtungsfeld zu messen, haben wir Fotopapier (Ilford Multigrade RC DeLuxe 44 M Pearl) 1 Sekunde lang blauem Licht ausgesetzt, das von LITOS mit unterschiedlichen Intensitäten erzeugt wurde, wie in der Legende angegeben. Wir positionierten das Fotopapier mit identischen Belichtungen in verschiedenen Abständen von der LED-Matrix über einem 0,17-mm-Glasobjektträger. Nachdem wir das Fotopapier mit blauem Licht belichtet hatten, entwickelten wir es 1 Minute lang. Die Fotos der Beleuchtungsfelder wurden in Graustufen mit einer Auflösung von 400 dpi gescannt. Intensitätsprofile der Beleuchtungsfelder wurden mit ImageJ 1.53 erstellt.

Der ESP32, der sich auf der Platine befindet, wird in C/C++ unter Verwendung der Arduino-Hardware-Abstraktionsschicht programmiert. Die Konfigurationsschnittstelle ist in Vue programmiert, einem fortschrittlichen Web-Framework zum Erstellen der Konfigurationsschnittstelle als Single-Page-Anwendungen (https://vuejs.org/). Den Quellcode finden Sie in unserem GitHub-Repository (https://github.com/pertzlab/LITOS).

Die embryonale Fibroblastenzelllinie NIH3T3 der Maus war ein Geschenk von T. Hunter, Salk Institute for Biological Studies in La Jolla, Kalifornien. Die nicht tumorigene menschliche Brustepithelzelllinie MCF10A war eine Schenkung von JS Brugge, Harvard Medical School, Boston, MA. Wir hielten NIH3T3-Zellen in Dulbeccos Modified Eagle's Medium-High Glucose (DMEM) von Sigma-Aldrich (Ref.: D5671), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 200 U/ml Penicillin und 200 µg/ml Streptomycin und 200 nM l -Glutamin. Vor der Passage wurde die Konfluenz unter 40–50 % gehalten, um Verhaltensänderungen der NIH3T3-Zellen zu vermeiden. Die MCF10A-Zellen wurden in DMEM:F12 (D8437) von Sigma-Aldrich gehalten, ergänzt mit 5 % Pferdeserum, 200 U/ml Penicillin und 200 µg/ml Streptomycin, 20 ng/ml EGF (Peprotech), 10 µg/ml Insulin ( Sigma-Aldrich/Merck) und 0,5 µg/ml Hydrocortison (Sigma-Aldrich/Merck).

NIH3T3- und MCF10A-Zellen wurden in einem Medium ausgehungert, das aus Ham's F-12-Nährstoffmischung (Sigma N4888) mit 200 U/ml Penicillin und 200 µg/ml Streptomycin sowie 200 nM L-Glutamin und 0,5 % Rinderserumalbumin für die NIH3T3-Zellen bestand DMEM:F12 (Sigma D8437), ergänzt mit 0,3 % BSA, 0,5 µg/ml Hydrocortison und 200 U/ml Penicillin und 200 µg/ml Streptomycin für MCF10A-Zellen. NIH3T3- und MCF10A-Zellen wurden stabil modifiziert, um optoFGFR (fusioniert mit einem mCitrin-Fluoreszenzprotein) oder optoRAF (ebenfalls fusioniert mit einem mCitrin-Fluoreszenzprotein) zu exprimieren. OptoFGFR wurde durch einen lentiviralen Vektor (Lyn-cytoFGFR1-PHR-mCit) und optoRAF durch ein PiggyBac-Plasmid (pPB3.0.PURO.CRY2.cRAF.mCitrine.P2A.CIBN.KrasCT) transduziert. Beide Systeme exprimieren eine Puromycin-Resistenz, die wir zur Auswahl stabil transduzierter Zellen verwendet haben. Die Zelllinien, die diese optogenetischen Aktoren exprimieren, wurden weiter mit zwei zusätzlichen PiggyBac-Plasmiden transfiziert, um ERK-KTR-mRuby2 mit Hygromycin-Resistenz und den Kernmarker H2B-miRFP703 mit Blasticidin-Resistenz stabil zu exprimieren. Für NIH3T3-Zellen wurden die PiggyBac-Plasmide mit dem JetPEI-Transfektionsreagenz transfiziert. Für die MCF10A-Zellen wurden die Plasmide mit dem FuGENE HD-Transfektionsreagenz (Sigma) transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen mit Antibiotika selektiert. Zusätzlich wurden NIH3T3 FACS-sortiert, während MCF10A-Zellen klonal expandiert wurden, um die Homogenität der Expression der Biosensoren zu erhöhen.

Wir haben 2 * 103 NIH3T3-Zellen/Well in einer 96-Well-Platte für die Bildgebungsexperimente und 1,5 * 106 MCF10A-Zellen/Well in einer 6-Well-Platte für das Western Blot ausgesät. In beiden Fällen verwendeten wir vor der Aussaat eine Stunde lang optische Multiwellplatten mit Glasboden, die mit 10 μg/ml Fibronektin beschichtet waren. Vor Beginn des Experiments wurden die Zellen 24 Stunden lang ausgehungert.

Für alle Experimente wurden die LITOS-Beleuchtungsmuster in LibreOffice Calc erstellt. Um die CSV-Dateien hochzuladen, haben wir einen Laptop an den Zugangspunkt von LITOS angeschlossen und die Benutzeroberfläche verwendet. Anschließend wurde die Multiwellplatte auf die LED-Matrix im Inkubator gestellt. Um die ordnungsgemäße Platzierung der Wellplatte sicherzustellen, verwendeten wir eine speziell mit einer CNC-Fräsmaschine hergestellte Plexiglasmaske (ergänzende Abbildung S3c). Den Zellen wurde erlaubt, sich mindestens eine Stunde lang an die Bedingungen des Inkubators anzupassen, bevor ein optogenetisches Experiment gestartet wurde. Sofern es das Versuchsprotokoll erlaubte, haben wir es vermieden, den Inkubator während des Experiments zu öffnen. Nach der Stimulation wurden die Zellen durch Zugabe des gleichen Volumens 4 %iger Paraformaldehydlösung zum in der Vertiefung vorhandenen Mediumvolumen fixiert. Bei allen gezeigten Experimenten wurden die verschiedenen Versuchspunkte zu bestimmten Zeitpunkten stimuliert, um sie dann am Ende des Experiments gleichzeitig zu fixieren. Nach 10-minütiger Fixierung wuschen wir die Zellen zweimal mit PBS.

Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopiebilder wurden mit einem Nikon Eclipse Ti-Mikroskop aufgenommen, das mit 20× Plan Apo Lambda (NA 0,75) und einer Andor Zyla 4.2+ Kamera ausgestattet war. Zur Anregung verwendeten wir die folgenden LED-Lichtquellen: 555 nm für ERK-KTR und 640 nm für Nuklearmarker. Zur Stimulation von optoFGFR verwendeten wir eine 488-nm-LED-Lichtquelle. Die bildgebende Analyse wurde mit einer in unserem Labor eingerichteten Pipeline durchgeführt16. Zuerst haben wir mit der Ilastik-Software (Version 1.3.3) eine Wahrscheinlichkeitskarte der Kerne erstellt und dabei den H2B-Kernmarker als Eingabebild verwendet. Ilastik extrahiert Pixelmerkmale mithilfe einer Filterbank und klassifiziert sie mithilfe eines Random-Forest-Algorithmus. Anschließend führten wir eine Instanzsegmentierung in CellProfiler (Version 3.0.0) durch und segmentierten das Zytosol ringförmig, beginnend 2 px vom Kern entfernt und mit einer maximalen Breite von 5 px (Abb. 4b). Der Abstand von 2 px zwischen der Kern- und Zytosolsegmentierung stellt sicher, dass Ungenauigkeiten bei der Kernsegmentierung keinen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Nachdem wir das ERK-KTR-Signal mit diesen beiden Segmentierungsmasken gemessen hatten, berechneten wir das Verhältnis zwischen dem im Zytosol und im Zellkern vorhandenen ERK-KTR (C/N-Verhältnis). Die relative zytoplasmatische gegenüber der nuklearen Fluoreszenz des KTR-Konstrukts (C/N-Verhältnis) korreliert mit der ERK-Aktivität und kann als Proxy für die Kinaseaktivität in einzelnen Zellen verwendet werden.

Für das Western Blot wurden die Zellen zunächst 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann in 2 % SDS-Puffer (in TrisHCl, pH 6,8) lysiert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Ref. 23227, Thermo Scientific) bestimmt. Von jedem Zelllysat wurden 10 µg Protein auf ein SDS-Page (10 % selbst hergestelltes Gel) geladen und dann auf eine PVDF-Western-Blot-Membran (Ref: 3010040001, Roche) geblottet. Die Membran wurde mit monoklonalem Kaninchen-Antikörper gegen Gesamt-ERK (Ref. Nr. 4695) oder monoklonalem Kaninchen-Antikörper gegen Phospho-ERK (Ref. Nr. 4370), beide von Cell Signaling, und dann mit Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked Whole Ab ( vom Esel, NA934VS), als sekundärer Antikörper. Die Membran wurde dann mit Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents (RPN2232) von GE Healthcare entwickelt.

Einzelzellendaten werden mit Boxplots oder Mittelwerten mit Standardfehler des Mittelwerts dargestellt, wie in der entsprechenden Abbildungslegende beschrieben. Datenanalyse und Zahlen wurden mit R (Version 3.6.3, https://www.r-project.org/)30 erstellt. Entsprechende Daten- und R-Notebook-Dateien, die zur Datenanalyse und Bilderstellung verwendet werden, finden Sie im Zusatzmaterial.

Alle Datensätze, einschließlich der zur Analyse verwendeten R-Notebooks, sind in den Zusatzinformationen enthalten.

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Diese Arbeit wurde durch den Schweizerischen Nationalfonds Grant Div3 310030_185376 an Olivier Pertz (Schweizerischer Nationalfonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung) unterstützt. Wir danken der technischen Werkstatt des Departements für Chemie, Biochemie und Pharmazeutische Wissenschaften, dem Microscopy Imaging Center (https://www.mic.unibe.ch) der Universität Bern und Tim Oliver Rod von der Berner Akademie der Künste (https://www.hkb.bfh.ch/de/) für technischen Support.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Thomas Christoph Höhener und Alex Erich Landolt.

Institut für Zellbiologie, Universität Bern, 3012, Bern, Schweiz

Thomas Christoph Höhener, Alex Erich Landolt, Coralie Dessauges, Lucien Hinderling, Paolo Armando Gagliardi & Olivier Pertz

Departement Biosystemwissenschaften und -technik, ETH Zürich, 4058, Basel, Schweiz

Alex Erich Landolt

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TH konzipierte das optogenetische Plattendesign. AL übernahm die Hard- und Softwareentwicklung. CD baute den genetischen Schaltkreis bestehend aus optoFGFR, optoRaf und dem ERK-KTR auf. PAG produzierte die MCF10A-Zelllinien mit optoFGFR, optoRaf und ERK-KTR. TH führte die zellbasierten Experimente durch und analysierte sie. TH, PAG und LH führten die Beleuchtungsfeldmessungen durch. TH hat alle Figuren erstellt. LH hat das 3D-gedruckte Gehäuse erstellt. OP überwachte die Arbeiten. TH, PAG und OP haben den Artikel geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Olivier Pertz.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Zusatzvideo 1.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Höhener, TC, Landolt, AE, Dessauges, C. et al. LITOS: ein vielseitiges LED-Beleuchtungsgerät zur optogenetischen Stimulation. Sci Rep 12, 13139 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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Eingegangen: 01. März 2022

Angenommen: 25. Juli 2022

Veröffentlicht: 30. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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