Das CLE33-Peptid unterdrückt die Phloemdifferenzierung über autokrine und parakrine Signale in Arabidopsis

Jul 23, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 588 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Pflanzenmeristeme erfordern eine ständige Versorgung der sich teilenden meristematischen Zellen mit Photoassimilaten und Hormonen. In der wachsenden Wurzel erfolgt diese Versorgung durch Protophloem-Siebelemente. Aufgrund seiner herausragenden Funktion für das Wurzelapikalmeristem ist Protophloem das erste Gewebe, das sich differenziert. Dieser Prozess wird durch einen genetischen Schaltkreis reguliert, an dem auf der einen Seite die positiven Regulatoren DOF-Transkriptionsfaktoren OCTOPUS (OPS) und BREVIX RADIX (BRX) und auf der anderen Seite die negativen Regulatoren CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION RELATED (CLE) Peptide und deren beteiligt sind Verwandte Rezeptoren KAUM KEINE MERISTEM (BAM)-Rezeptor-ähnlichen Kinasen. brx- und ops-Mutanten beherbergen ein diskontinuierliches Protophloem, das durch Mutation in BAM3 vollständig gerettet werden kann, aber nur teilweise gerettet wird, wenn alle drei bekannten Phloem-spezifischen CLE-Gene, CLE25/26/45, gleichzeitig mutiert werden. Hier identifizieren wir ein CLE-Gen, das eng mit CLE45 verwandt ist und den Namen CLE33 trägt. Wir zeigen, dass die Doppelmutante cle33cle45 den Brx- und Ops-Protophloem-Phänotyp vollständig unterdrückt. CLE33-Orthologe kommen in basalen Angiospermen, Monokotyledonen und Eudikotyledonen vor, und die Genduplikation, die zu CLE45 bei Arabidopsis und anderen Brassicaceae führte, scheint ein neues Ereignis zu sein. So entdeckten wir ein bisher nicht identifiziertes Arabidopsis-CLE-Gen, das eine wesentliche Rolle bei der Protophloembildung spielt.

In Gefäßpflanzen transportieren Phloemgewebe Zucker und Signalmoleküle zu Senkenorganen für Wachstum und Speicherung1,2. In der wachsenden Arabidopsis-Wurzel ist das apikale Wurzelmeristem eine große Senke und zwei Phloemstangen, die funktionelle Siebelemente enthalten, entladen den Phloemsaft in der meristematischen Region3. Jeder Pol besteht aus einem Protophloem-Siebelement, das von außen von zwei Phloempol-Pericycluszellen und von innen von einem Metaphloem-Siebelement flankiert wird, sowie aus zwei an diese Siebelementzellen angrenzenden Begleitzellen. Diese komplexe Struktur fungiert als funktionelle Einheit4. Bemerkenswert ist, dass die Abgabe von Zuckern und Hormonen an das Wurzelmeristem ausschließlich durch Protophloem-Siebelemente vermittelt wird, während Metaphloem-Siebelemente in dieser Region der Wurzel undifferenziert bleiben5.

Der Prozess der Bildung von Protophloem-Siebelementen erfordert radikale zelluläre Modifikationen, einschließlich Zellwandverstärkung, Enukleation und Siebplattenbildung6,7. Die genetische Kontrolle der Protophloementwicklung bei Arabidopsis wurde im letzten Jahrzehnt intensiv untersucht4,6,8,9,10,11, einschließlich einer präzisen Transkriptomanalyse des gesamten Phloempols4 und der sich entwickelnden Siebelemente6. Die Protophloem-Differenzierung wird durch mehrere Regulatoren gesteuert, wie z. B. Hormongradienten, DOF-Transkriptionsfaktoren und SMXL-Transkriptionsrepressoren9,12. Darüber hinaus wirken zwei membranlokalisierte Proteine, BREVIS RADIX (BRX) und OCTOPUS (OPS), als positive Regulatoren der Protophloementwicklung8,10. BRX- und OPS-Funktionsverlustmutanten weisen ein diskontinuierliches Protophloem auf, das durch sogenannte Gap-Zellen gekennzeichnet ist, die sich nicht differenzieren können. Die unterbrochene Protophloem-Kontinuität führt zu einer verringerten Phloem-Saftabgabe an das Wurzel-Apikalmeristem und zu einem begrenzten Wurzelwachstum8,10. Kaum ein Meristem 3 (BAM3) wurde in einem Brx-Suppressor-Screening identifiziert, wobei Bam3 sowohl das Wurzelwachstum als auch die Gap-Cell-Phänotypen von Brx und Ops10 rettete. BAM3 kodiert für eine Leucin-reiche Wiederholungsrezeptorkinase (LRR-RLK), einen verwandten Rezeptor des CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION 45 (CLE45)-Peptids13. Während kürzlich gezeigt wurde, dass eine Mutante höherer Ordnung von Phloem-exprimierten CLE-Genen (CLE25/26/45) den Phänotyp der Brx- und Ops-Gap-Zellen teilweise rettet, erreicht diese Rettung nicht das Niveau der vollständigen Rettung, die in bam314 erreicht wurde. Diese phänotypische Diskrepanz zwischen dem Rezeptor und seinen Liganden legt nahe, dass noch weitere endogene CLE-Peptide, BAM3-Liganden, identifiziert werden müssen.

CLE-Peptide werden aus einem etwa 100 Aminosäuren langen Präpropeptid hergestellt, das in seinem N-Terminus ein Signalpeptid für die apoplastische Freisetzung, eine zentrale variable Region und eine konservierte 12–13 Reste lange CLE-Domäne in seinem C-Terminus besitzt, die gespalten wird ausgeschaltet, um das reife CLE-Peptid freizusetzen. Aufgrund der geringen Gengröße und der hohen Sequenzvariabilität außerhalb der CLE-Domäne kann die Annotation des Genoms von CLE-Genen eine Herausforderung darstellen. Bei Arabidopsis stammten ihre Entdeckungen zunächst aus einem Mutantenscreening15,16 nach dem Klonen von CLV317. Die erste Veröffentlichung des Arabidopsis-Genoms18 ermöglichte die Identifizierung weiterer Mitglieder der CLE-Familie in mehreren Iterationen19,20,21,22,23. Bis heute sind 32 CLE-Gene annotiert, die für 27 einzigartige Peptide kodieren. Wir haben kürzlich die CLE-Genfamilie in Tomaten untersucht und 37 neue CLE-Gene gefunden24, was die Frage aufwirft, ob in Arabidopsis noch weitere CLE-Gene entdeckt werden müssen.

Hier präsentieren wir die Identifizierung des Arabidopsis-CLE33-Gens, das in früheren Genomanalysen übersehen wurde. Wir zeigen, dass dieses Gen im sich entwickelnden Wurzel-Phloem exprimiert wird und für ein aktives Peptid kodiert, das redundant mit CLE45 über den BAM3-Rezeptor wirkt und die Protophloem-Differenzierung in der Protophloem-Zelllinie und benachbarten Zellen hemmt.

Um nach weiteren Arabidopsis-CLE-Genen zu suchen, führten wir eine nicht-stringente t-BLAST-n-Analyse durch, wobei wir die 32 zuvor bekannten CLE-Proteine ​​voller Länge aus A. thaliana als Abfragen verwendeten. Wir haben eine Sequenz in einer nicht annotierten Region von Chromosom 1 gefunden, die alle Merkmale eines CLE-Gens aufweist, einschließlich der Anwesenheit eines funktionellen Signalpeptids. Bei anderen Brassicaceae-Arten ist dieser genetische Ort konserviert und wird als CLE45-ähnliches Homolog bezeichnet (ergänzende Abbildung 1a). In A. thaliana wird dieser Locus transkribiert, was die Expression des Gens bestätigt, das wir CLE33 genannt haben (Abb. 1b und ergänzende Abb. 1b). Basierend auf seiner Proteinsequenz voller Länge haben wir festgestellt, dass CLE33 das engste Homolog des gut charakterisierten, im Phloem exprimierten CLE45 ist (Abb. 1a)10,11,13.

ein phylogenetischer Baum der CLE-Präpropeptide voller Länge von Arabidopsis thaliana. Die blaue Linie zeigt den Cluster, der im Wurzel-Phloem-Gewebe exprimiert wird. b Araport11-RNA-seq-basierter Nachweis der Transkription aus der Kartierungsabdeckung der mit JBrowse visualisierten, unter Lichtbedingungen gewachsenen Sämlinge. Die relative Position der vorhergesagten CLE33-Kodierungssequenz ist schematisch dargestellt: Signalpeptid in Grün, CLE-Domäne in Blau. c Transkriptionsfusionen, die die Promotoraktivität von CLE33, CLE45 und CLE26 im Wurzelprotophloemgewebe zeigen. Maßstabsbalken = 50 μm.

Um Einblicke in das Expressionsmuster von CLE33 zu erhalten, haben wir dessen Promotorregion geklont, um einen GUS-Reporter anzutreiben (ergänzende Abbildung 1c). Die CLE33-Expression war insbesondere mit der Gefäßversorgung im Wurzelmeristem, der Rosettenverbindung und den Blättern, Keimblättern und dem Blütenstandsstamm verbunden. Um das exprimierte Gewebe genau zu bestimmen, verwenden wir denselben Promotor und zwei zusätzliche Phloem-spezifische CLEs (CLE26 und CLE45), um die Expression des nuklearen Fluoreszenzproteins NLS-Citrin zu steuern (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1d). Im Wurzelmeristem werden alle drei spezifisch im Protophloemgewebe exprimiert, allerdings mit geringfügigen Unterschieden im Expressionsbeginn. Die CLE45-Expression kann früh in den Siebelement-Vorläuferzellen beobachtet werden, unmittelbar nach der ersten periklinalen Zellteilung des Siebelement-Procambium-Vorläufers. Die CLE33-Expression beginnt einige Zellen später in den sich entwickelnden Protophloem-Siebelementzellen und überlappt weitgehend mit der Expressionsdomäne von CLE45. CLE26 ist gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten25,26 in den späteren Stadien der Siebelementdifferenzierung aktiv, wenn die Zellwandverdickung stattgefunden hat25,26.

Die meisten CLE-Peptide induzieren einen Wurzelwachstumsstopp, wenn sie überexprimiert oder in nanomolaren Konzentrationen dem Wachstumsmedium zugesetzt werden, und werden daher als wurzelaktiv bezeichnet13,26. Um festzustellen, ob das CLE33-Peptid auch das primäre Wurzelwachstum hemmen kann und welche Rezeptoren an der Wahrnehmung dieses Peptids im Wurzelmeristem beteiligt sind, haben wir das CLE33-Peptid in einer steigenden Konzentration von 0 bis 300 nM in das Wachstumsmedium gegeben und die Hemmwirkung des Wurzelwachstums im Wurzelmeristem untersucht Wildtyp- und Funktionsverlust-CLE-Rezeptormutanten (Abb. 2a). Im Wildtyp wurde das Wurzelwachstum mit 3 nM CLE33 gehemmt und verstärkte sich bei höheren Konzentrationen. Wie bei anderen bekannten wurzelaktiven CLEs war diese Reaktion selbst bei den höchsten Konzentrationen vollständig CLV2/CORYNE-abhängig13. Im Gegensatz dazu zeigten Bam-Mutanten unterschiedliche Reaktionen. bam2-4 zeigte eine ähnliche Empfindlichkeit gegenüber dem Wildtyp, wohingegen bam1-3 gegenüber CLE33p überempfindlich war. Diese etwa dreifache Überempfindlichkeit wurde auch bei CLE26- und CLE45-Peptiden (ergänzende Abbildung 2a, b) und gegenüber CLE33-Peptid im unabhängigen bam1-4-Allel (ergänzende Abbildung 2d) beobachtet. Andererseits waren bam3-Mutanten bis zu 100 nM CLE33-Peptid unempfindlich und zeigten nur eine Reaktion bei einer sehr hohen Konzentration von 300 nM (Abb. 2a und ergänzende Abb. 2c). Nur in Kombination mit dem Funktionsverlust von BAM1 wurde eine vollständige Unempfindlichkeit erreicht, was darauf hindeutet, dass BAM1 eine Rolle bei der Vermittlung von Wurzelwachstumsreaktionen auf synthetische CLE33-Peptide in hoher Konzentration spielt. Um diesen Befund unter genaueren physiologischen Bedingungen weiter zu testen, verwendeten wir das XVE-Östradiol-induzierbare System, um CLE33 ektopisch zu exprimieren (ergänzende Abbildung 3). Während der Wildtyp stark auf die ektopische Induktion von CLE33 reagierte, blieben die bam3-2-Linien selbst bei hohen Östradiolkonzentrationen unempfindlich. Diese Ergebnisse legen nahe, dass synthetische und endogene CLE33-Peptide BAM3 für die Hemmwirkung des Wurzelwachstums benötigen.

a Dosisabhängige Hemmung des Wurzelwachstums durch CLE33p im Wildtyp und bei CLE-Rezeptormutanten. b Wurzelwachstumshemmung mit synthetischen Peptiden CLE33 (30 nM), CLE45 (30 nM), CLE26 (3 nM). c Wurzelwachstumshemmung der CLE33-Peptidvarianten CLE33M2K, CLE33G4P, CLE33S7P (30 nM). a–c Buchstaben kennzeichnen unterschiedliche statistische Gruppen (ANOVA, Post-hoc-Tukey-Test).

Es wurde gezeigt, dass BAM3 der verwandte Rezeptor des CLE45-Peptids ist und Bam3-Mutanten eine ähnliche Unempfindlichkeit gegenüber CLE33- und CLE45-Peptiden aufweisen (Abb. 2b und ergänzende Abb. 2a). Diese einzigartige BAM3-Abhängigkeit ist sehr spezifisch für die Peptide CLE33 und CLE45, nicht jedoch für das eng verwandte Peptid CLE26 (ergänzende Abbildung 2b). Beim Vergleich der Aminosäuresequenzen dieser drei Peptide stellten wir fest, dass die konservierten Proline an den Positionen 4 und 7 in CLE33 durch Glycin und Serin und in CLE45 durch Arginin und Serin ersetzt wurden (Abb. 2b). Um die Bedeutung dieser Aminosäuren für die Rezeptorspezifität weiter zu untersuchen, haben wir Varianten von CLE26 und CLE33 erstellt und getestet, indem wir Reste zwischen diesen beiden Peptiden ausgetauscht haben. Zunächst beobachteten wir, dass alle Peptidvarianten (CLE26P4G, CLE26P7S, CLE26P4G/P7S, CLE33M2K, CLE33G4P, CLE33S7P) im Wildtyp eine starke Hemmwirkung auf das Wurzelwachstum hatten, in der crn-10-Mutante jedoch weitgehend keine Wirkung, was darauf hindeutet, dass die Aminosäuren Substitutionen hatten keinen Einfluss auf ihre Fähigkeit, das Wurzelwachstum zu unterdrücken (Abb. 2c und ergänzende Abb. 4). Allerdings hing die BAM3-Abhängigkeit stark von den Resten an den Positionen 4 und 7 ab. Das Vorhandensein eines Prolins an Position 4 oder 7 in CLE33 führte zu einer BAM3-unabhängigen Reaktion (Abb. 2c) und umgekehrt mussten beide Proline ersetzt werden in CLE26, um das Wurzelwachstum in der bam3-Mutante nicht zu hemmen (ergänzende Abbildung 4). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass das Fehlen von Prolinen in Position 4 und 7 die BAM3-Wahrnehmungsspezifität der CLE33- und CLE45-Peptide bestimmt.

Es wurde zuvor gezeigt, dass die Entwicklung des Wurzelprotophloems durch wurzelaktive CLE-Peptide, die dem Wachstumsmedium zugesetzt werden, unterdrückt wird13. Um die Wirkung von CLE33 auf die Protophloem-Identität zu testen, haben wir die Expression des Protophloem-Markers pCVP2:NLS-3xVenus bei Behandlung mit CLE33-Peptid über Nacht bewertet (ergänzende Abbildung 5). Die hemmende Wirkung von CLE33 auf die Protophloem-Identität war ähnlich der Wirkung von CLE26 und CLE45, was darauf hindeutet, dass CLE33 als negativer Regulator der Protophloem-Differenzierung fungiert.

Um die biologische Funktion von CLE33 in Planta und seine genetische Beziehung zu CLE45 zu verstehen, haben wir CRISPR-Cas9-vermittelte Knock-out-Mutanten im Wildtyp- und cle45-2-Hintergrund erstellt (ergänzende Abbildung 6). Ebenso wie bam3¸ zeigen die einzelnen cle33- und doppelten cle33cle45-Mutanten unter unseren Bedingungen keinen reproduzierbaren Wurzelwachstums-Makrophänotyp (Abb. 3 und ergänzende Abb. 7). In Übereinstimmung mit früheren Berichten können BAM3-Funktionsverlustmutanten die diskontinuierliche Protophloem-Differenzierung von brx und ops8,10 vollständig wiederherstellen, was bei cle4514 nicht der Fall ist. Wir fragten, ob diese phänotypische Diskrepanz auf das Vorhandensein des verbleibenden CLE33 im Protophloemgewebe zurückzuführen sei. Um dies weiter zu untersuchen, haben wir die Doppelmutante cle33-3 cle45-2 mit brx-3 und ops-2 gekreuzt. Die Mutation in CLE33 allein hatte keinen oder nur einen sehr geringen Einfluss auf die Rettung des Wurzelwachstums und der Protophloem-Kontinuität von brx-3 und ops-2 (Abb. 3 und ergänzende Abb. 7). Wir konnten ein zuvor veröffentlichtes Ergebnis reproduzieren, bei dem cle45 den Phänotyp des Wurzelwachstums teilweise unterdrückte, die Häufigkeit der Protophloem-Lückenzellen jedoch nicht signifikant reduzierte . Die Kombination von cle33 und cle45 könnte die Phänotypen Wurzelwachstum und Protophloem-Diskontinuität vollständig retten, was stark darauf hindeutet, dass CLE33 und CLE45 in diesem genetischen Kreislauf redundant wirken (Abb. 3 und ergänzende Abb. 7). Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse eine negative Rolle von CLE33 bei der Protophloem-Differenzierung.

a Wurzellänge 10 Tage nach der Keimung. Buchstaben kennzeichnen unterschiedliche statistische Gruppen (ANOVA, Post-hoc-Tukey-Test). b Repräsentative konfokale Bilder von mit Calcofluor-Weiß gefärbten Wurzeln. Rote Pfeile zeigen Protophloem-Lückenzellen an. Maßstabsbalken entsprechen 100 μm. c Quantifizierung der Lückenzellfrequenz. Buchstaben geben statistische Gruppen an (χ2-Test mit Benjamini-Hochberg-Korrektur).

Das durch den Funktionsverlust von BRX oder OPS verursachte Versagen der Protophloementwicklung könnte durch hohe Dosierungen des Rezeptors BAM3 oder phloemspezifischer CLE-Liganden erklärt werden. Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir die Transkriptakkumulation in Brx- und Ops-Wurzelgeweben quantifiziert. Wir fanden heraus, dass BAM3 auf Transkriptionsebene nicht hochreguliert ist und CLE25, CLE26 und CLE45 sogar eine signifikante Verringerung ihrer Expression zeigten (ergänzende Abbildung 8a), was darauf hindeutet, dass die erhöhte BAM3/CLE33/45-vermittelte Signalübertragung in brx und ops Mutante wird durch einen anderen Mechanismus verursacht.

Bei der Analyse der Protophloem-Kontinuität stießen wir auf einen zusätzlichen Phänotyp ektopischer siebelementartiger Zellen, die aus benachbarten Zellen neben der Hauptzelldatei des Protophloem-Siebelements stammten. Diese Zelldateien zeigen Merkmale der sich entwickelnden Siebelemente, einschließlich einer Verdickung der Zellwand (Abb. 4a). Ein verwandter Phänotyp wurde kürzlich in den Mutanten mit mehreren Funktionsverlusten in Phloem-CLEs, BAM-Rezeptor- und CIK-Co-Rezeptor-Mutanten gezeigt, die zeigten, dass die CLE-Signalisierung benachbarte Zellen daran hindert, sich in Siebelemente zu differenzieren9. Diese frühere Analyse wurde zu einem späteren Zeitpunkt der Phloementwicklung durchgeführt, als sich sowohl Protophloem-Siebelemente als auch Metaphloem-Siebelemente differenziert hatten und dicke Zellwände besaßen9. Bei unseren Analysen haben wir uns auf die meristematische Zone konzentriert. Wir haben die Häufigkeit der ektopischen Protophloem-Differenzierungsereignisse in unseren Mutanten quantifiziert. Wir fanden eine erhöhte ektopische Differenzierung in Abwesenheit von BAM3 und in den Dreifachmutanten cle33 cle45 brx und cle33 cle45 ops, jedoch nicht in den Doppelmutantenkombinationen (Abb. 4b und ergänzende Abb. 8b). Dieser Unterschied könnte auf eine schwächere Phloemidentität in Abwesenheit von brx und ops und/oder verringerte CLE25/CLE26-Spiegel in diesen Hintergründen zurückzuführen sein (ergänzende Abbildung 8a), von denen bekannt ist, dass sie die Bildung ektopischer Siebelemente unterdrücken9. Dennoch zeigen die Ergebnisse unserer Analyse, dass CLE33 und CLE45 redundant die Bildung der ektopischen Protophloem-Siebelemente hemmen (Abb. 4c und ergänzende Abb. 7).

a Konfokale Bilder von mit Calcofluor-Weiß gefärbten Wurzeln. Blaue Pfeile zeigen Zelldateien an, die eine Zellwandverstärkung zeigen, ein Zeichen dafür, dass sie einen Protophloem-Differenzierungsprozess durchlaufen. Maßstabsbalken entsprechen 50 μm. b Häufigkeit der ektopischen Protophloem-Differenzierung in Wurzeln. Buchstaben geben statistische Gruppen an (χ2-Test mit Benjamini-Hochberg-Korrektur). c Schematisches Modell der autokrinen und parakrinen Signalübertragung, die durch die CLE33/45-Peptide über den BAM3-Rezeptor vermittelt wird.

Kürzlich wurde gezeigt, dass CLE25, CLE26 und CLE45 DOF-Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in ihrer Promotorregion haben und durch DOF2.29 induziert werden. Unsere Analyse der CLE33-Promotorregion ergab ähnliche Bindungsstellen für DOF2.2, DOF2.4/PEAR1, DOF3.2, OBP3, DOF5.1/PEAR2 und DOF5.6 (ergänzende Abbildung 8c). Dieses Ergebnis legt nahe, dass CLE33 ein wesentlicher Akteur im genetischen DOF-CLE-Kreislauf sein kann.

Die beiden peptidkodierenden Gene CLE33 und CLE45 scheinen funktionell redundant zu sein (Abb. 3 und 4) und weisen eine hohe Ähnlichkeit in Sequenz und Expressionsmustern auf (Abb. 1). Daher könnten sie das Ergebnis eines Genduplikationsereignisses sein. Um mehr über ihren evolutionären Ursprung zu erfahren, führten wir eine phylogenetische Analyse verschiedener Gefäßpflanzenarten durch. Wir identifizierten CLE33-Orthologe im Genom von basalen Angiospermen, Monokotylen und Eudikotylen, nicht jedoch von Gymnospermen, was darauf hindeutet, dass sie vor etwa 200 Millionen Jahren entstanden sind (ergänzende Abbildung 9a). Interessanterweise wurden klare CLE45-Orthologe nur in Brassicales-Arten gefunden. Ein Multisequenz-Alignment ergab, dass Brassicales CLE45 im N-terminalen Teil unmittelbar nach dem Signalpeptid eine erweiterte variable Region ohne Homologie zu anderen CLE33/45-ähnlichen Proteinen aufweist (ergänzende Abbildung 9b). Bei der spezifischen Analyse der CLE-Domäne stellten wir jedoch fest, dass CLE45 den CLE33-Orthologen der Vorfahren ähnlicher ist (ergänzende Abbildung 9c). Eine Möglichkeit für ein solches Vorkommen besteht darin, dass nach einer Duplikation in frühen Brassicales eine Kopie schnell genetisch in ihrer variablen Region wanderte, was zur Entstehung des aktuellen CLE45 führte. In einem solchen Szenario behielt Brassicales CLE33 den größten Teil der angestammten Sequenz bei, mit Ausnahme der Reste 2/3/4 in seiner CLE-Domäne. Bemerkenswerterweise weisen alle Orthologen von CLE33 und CLE45 keine Proline an den Positionen 4 und 7 auf, was unserer Ansicht nach für die Spezifität der Rezeptorwahrnehmung bei Arabidopsis von Bedeutung ist (Abb. 2).

Darüber hinaus untersuchten wir den evolutionären Ursprung von BAM3, dem Gen, das für den Rezeptor kodiert, der diese beiden Liganden wahrnimmt. Wir fanden Orthologe, die bis zu den Gymnospermen vorhanden waren (ergänzende Abbildung 10). Eine frühe Vervielfältigung in den Angiospermen brachte zwei Kopien hervor: BAM3 und BAM4. Während BAM3 in allen Angiospermengruppen vorkommt, fehlt BAM4 in den Genomen von Brassicaceae-Arten besonders. Der Verlust von BAM4 fällt mit dem Auftreten von CLE45 in Brassicales zusammen. Dennoch sind BAM4-Liganden und ihre Funktionen weiterhin unbekannt. Unsere Ergebnisse eröffnen neue Wege für die weitere Erforschung dieser Rezeptor-Liganden-Paare und ihrer potenziell konservierten Funktion während der gesamten Pflanzenentwicklung.

In den letzten Jahren wurden viele weitere für Peptidliganden kodierende Gene in Arabidopsis und anderen Pflanzenarten entdeckt24,27,28,29,30,31. Diese gehören zu bisher unbekannten Familien, wie den stressinduzierten CTNIPs/SCREWs-Peptiden27,28, oder zu gut charakterisierten Genfamilien, wie CIF/TWS131 und CLE in unserer Studie. Es scheint, dass in den Annotationen des Pflanzengenoms, einschließlich Arabidopsis, immer noch viele dieser peptidkodierenden Gene fehlen. Fortschrittliche Methoden wie Ribosomenprofilierung in Kombination mit Transkriptomik und Peptidomik32,33 haben jedoch große Erfolge bei der Identifizierung einiger Tausend solcher Gene in Medicago32 und Mais33 gezeigt. Darüber hinaus führten die genomweiten Analysen mithilfe von Hidden-Markov-Modellen34 zur Identifizierung neuer Peptide24,35. Mit Hilfe solch fortschrittlicher Methoden werden wir bald in der Lage sein, ein vollständiges Repertoire pflanzlicher Signalpeptide zu erhalten, die eine Vielzahl von Entwicklungs- und Anpassungsreaktionen regulieren.

In unserer Studie führten wir eine nicht stringente t-BLAST-n-Suche nach CLE-Genen durch, die es uns ermöglichte, das zuvor nicht annotierte CLE33 zu identifizieren. Proline an den Positionen 4 und 7 gehören zu den am stärksten konservierten Aminosäuren in CLE-Peptiden, und ihre Abwesenheit in CLE33/45 macht sie zu Ausnahmen und erklärt teilweise, warum diese Gene später identifiziert wurden22. Aus struktureller Sicht führt der Prolinrest aufgrund seiner unregelmäßigen Geometrie zu einzigartigen Konformationsänderungen36. Die Seitenkette des Prolins ist zweifach mit dem Peptidrückgrat verbunden, wodurch eine eigene Sekundärstruktur entsteht. Über den Beitrag von Prolinen zu den Wechselwirkungen mit den CLE-Rezeptor- und Co-Rezeptor-Bindungsoberflächen ist wenig bekannt. Es wurde jedoch gezeigt, dass in reifen CLE-Peptiden die Proline 4 und 7 eine Hydroxylierung eingehen und eines oder beide eine Glykosylierung mit 3, 4 oder 6 Arabinoseresten eingehen37. Es wurde gezeigt, dass das Hydroxyprolin in Position 4 im CLE40-Peptid die Fehlspaltung des Vorläuferpeptids verhindert38. Gleichzeitig hatten das Fehlen oder Vorhandensein einer Hydroxylierung im reifen CLE40-Peptid und die Substitution des Prolins in Position 4 durch Alanin (P4A) keinen Einfluss auf die Bioaktivität des Peptids in Wurzelwachstumstests38. Darüber hinaus hatte der Ersatz von Hydroxyprolinen in den Positionen 4 und 7 durch Proline in CLE9 keinen Einfluss auf die Bindungsaffinität zu BAM1 in vitro39, was darauf hindeuten könnte, dass Prolin 4 selbst und die Prolinhydroxylierung für die Peptid-Rezeptor-Wechselwirkung nicht wesentlich sind38,39. Unsere Bioaktivitätstests mit modifizierten CLE26- und CLE33-Peptiden weisen jedoch darauf hin, dass Proline an den Positionen 4 und 7 entscheidend für die Rezeptorspezifität sind. Es wurde gezeigt, dass in BAM3 die Q226Y228Y231-Reste für die CLE45-Bindung entscheidend sind13, aber wie das Fehlen der Proline 4 und 7 zur spezifischen Bindung mit BAM3 beiträgt, muss noch weiter geklärt werden.

Die Entstehung hochspezialisierter zuckerleitender Siebelemente war ein entscheidender Schritt in der Evolution der Landpflanzen. Diese Erfindung ermöglichte die Trennung von photosynthetischen Organen, die um Licht konkurrieren und zur Sonne hin wachsen müssen, und wasserabsorbierenden Organen, die tief in den Boden hineinwachsen. Primitive Siebelementdateien finden sich in Braunalgenarten und Moosen40, die oft nur einen teilweisen Protoplastenabbau und eine Enukleation zeigen. Alle nicht blühenden Gefäßpflanzen, einschließlich Gymnospermen, besitzen Siebzellen, die an beiden End- und Seitenwänden Siebflächen und keine Siebplatten aufweisen41. In Gymnospermen fehlen den leitenden Siebzellen benachbarte Begleitzellen und sie haben die Form länglicher spindelartiger Strukturen, die axial und seitlich durch Siebbereiche mit engen Siebporen verbunden sind, was zu einem höheren Strömungswiderstand und langsameren Transportraten führt. Angiospermen entwickeln hocheffiziente isolierte Phloem-Siebelemente mit Siebplatten an den Endwänden, die den schnellen Transport von Photoassimilaten erleichtern41,42. Hier haben wir einen neuen molekularen Akteur bei der Bildung des Wurzelprotophloems identifiziert, ein kleines Signalpeptid-Gen CLE33. In der Arabidopsis-Wurzel induzieren phloemspezifische DOF-Transkriptionsfaktoren eine Reihe positiver Regulatoren der Phloementwicklung und CLEs, die die DOF-Expression in einer Rückkopplungsschleife herunterregulieren9,12. Mit DOF-Bindungsstellen in seiner vorgelagerten regulatorischen Sequenz ist CLE33 wahrscheinlich an diesem genetischen Schaltkreis beteiligt. Wir haben gezeigt, dass CLE33 zusammen mit CLE45 der durch BRX/OPS vermittelten Siebelementdifferenzierung entgegenwirkt. Ein solcher Mechanismus kann möglicherweise eine Rolle dabei spielen, den richtigen Zeitpunkt für die Differenzierung von Siebelementen in Abhängigkeit von endogenen Signalen und Umweltbedingungen zu bestimmen. Darüber hinaus zeigen wir, dass CLE33 redundant mit CLE45 wirkt, um die Differenzierung der Protophloem-Nachbarzellen in Siebelemente zu unterdrücken. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CLE33/45 sowohl als autokrine als auch als parakrine Signale fungiert, wohingegen die beiden anderen Phloem-CLE-Gene (CLE25 und CLE26) eine begrenzte Rolle als autokrine Signale im BRX/OPS-BAM3-Modul spielen, das die Protophloem-Differenzierung reguliert. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein weiterer Akteur auf diesem Weg, RECEPTOR PROTEIN LIKE KINASE 2 (RPK2), an der Protophloem-Differenzierung beteiligt ist43. Die rpk2-Mutante mit Funktionsverlust konnte die Protophloem-Lücken-Phänotypen und das Wurzelwachstum von brx-, ops- oder cvp2cvl1-Mutanten teilweise retten43. Es wurde gezeigt, dass RPK2 genetisch mit BAM1 interagiert und die beiden Proteine ​​heteromere Komplexe bilden44, die mögliche Interaktion von RPK2 mit BAM3 ist jedoch noch nicht erforscht.

Die Fähigkeit der Protophloem-Siebelement-umgebenden Zellen, sich zu Siebelement-Zellen zu entwickeln, ist wichtig für die Entwicklungsplastizität dieses Gewebes43. Die Laserablation des sich entwickelnden Protophloems löst die Differenzierung benachbarter Zellen43 aus und umgeht dabei das ursprünglich unterbrochene Protophloem, um die Versorgung des Meristems mit Zucker und Hormonen aufrechtzuerhalten. Es scheint, dass die richtige Balance zwischen Unterdrückung und Aufrechterhaltung des Differenzierungspotentials zu Siebelementen im Fehlerfall für die Protophloemfunktion von entscheidender Bedeutung ist. Es bleibt zu beantworten, warum die Pflege nur einer einzigen funktionsfähigen Siebelementdatei einer so strengen genetischen Kontrolle unterliegt.

In höheren Gefäßpflanzen wurde der CLAVATA-Weg weitgehend erweitert, sowohl durch die Anzahl der CLE-Peptid-Gene als auch durch neue Komponenten der Rezeptorkomplexe, einschließlich Duplikationen von CLV1/BAM-ähnlichen RLKs und dem Auftreten des rezeptorähnlichen Proteins CLAVATA2 und Pseudokinase CORYNE45. Da CLE33-Orthologe in basalen Angiospermen gefunden wurden, ist es möglich, dass während der Pflanzenentwicklung Phloem-exprimierte CLEs rekrutiert wurden, um das einzigartige Angiospermen-Phloemgewebe zu formen, das bei der schnellen Translokation von Photoassimilaten effizient funktioniert.

Eine t-BLAST-n-Suche im A. thaliana-Genom in der EnsemblPlant-Datenbank wurde unter Verwendung der 32 zuvor bekannten CLE-Proteine ​​voller Länge aus A. thaliana als Abfragen durchgeführt. Um mehr Treffer zu erzielen, wurde der e-Wert-Schwellenwert auf 10 anstelle der ursprünglichen Einstellung von 10−1 festgelegt. Kandidatensequenzen, die nicht als CLE-Gene annotiert waren, wurden manuell mit den Abfragen verglichen. Nur Sequenzen, die der CLE-Domäne ähnlich sind, wurden weiter auf das Vorhandensein eines Signalpeptids, den Nachweis einer Expression und darauf, dass sie nicht Teil eines anderen beschriebenen Proteins sind, analysiert. Nach dem Filtern blieb eine einzige Sequenz in einer nicht annotierten Region von Chromosom 1 übrig, die alle Merkmale eines CLE-Gens aufwies: CLE33.

Alle in dieser Studie beschriebenen Mutanten befinden sich im Arabidopsis thaliana Columbia-0 (Col-0)-Hintergrund: clv2-113 crn-1013, bam1-3 (SALK_015302), bam1-4 (SALK_107290), bam2-4 (SAIL_1053_E09), bam3 -2 (SALK_044433)13, bam3-3 (SALK_118860), bam1-4 bam3-3, bam2-4 bam3-2, cle45-246, brx-347, ops-2 (SALK_139316)8.

Die Funktionsverlustmutanten in CLE33 wurden durch CRISPR-Cas9-Base-Gen-Editierung erzeugt. Das Design von Guide-RNAs mit wenigen Off-Targets wurde mit CCTop (10.1371/journal.pone.0124633) durchgeführt. Die Erzeugung der gRNA wurde durch Primer-Dimer-Annealing (C67xC68; C69xC70) erreicht und durch BsaI-Schnittligation in den Zielvektor pAGM5526148 kloniert. A. thaliana Col-0-Wildtyp und cle45-2 wurden durch ein Blumenbad in Agrobacterium tumefaciens-Suspension transformiert. Transgene Samen wurden auf DsRed-Fluoreszenz untersucht. Die Frameshift-erzeugenden Mutationen in CLE33 wurden in den nicht-transgenen Nachkommen gesucht. Mutanten höherer Ordnung wurden durch Kreuzung erhalten.

Gene und Promotorregionen wurden durch Phusion-PCR mit den in der Ergänzungstabelle 1 angegebenen Primern amplifiziert. Plasmide wurden wie in der Ergänzungstabelle 2 angegeben durch modulare Anordnung von Golden Gate konstruiert.

CLE33/CLE45- und BAM3-Homologe wurden von BLASTP in den Datenbanken Phytozome13 und PLAZA Gymnosperm durchsucht. In Carica papaya wurden keine Hinweise gefunden und es wurde ein t-BLAST-n durchgeführt, um die CLE33/45-Homologen zu finden. Tomaten-CLE-Sequenzen wurden aus24 abgerufen. Proteinsequenzen voller Länge wurden entweder mit MUSCLE ausgerichtet und manuell in MEGA-X50 für Abb. 1a oder mit MAFFT mit aktiviertem DASH51 für ergänzende Abbildungen kuratiert. S9 und S10. Die Ausrichtungen wurden verwendet, um Bäume mit 1000 Bootstrap-Replikaten mit IQTREE52 zu erzeugen und mit iTOL53 zu visualisieren. Die Syntenieanalyse des CLE33 in den Brassicaceae wurde mit dem Genome Context Viewer54 durchgeführt. Mit Alignmentviewer.org55 wurden Multisequenz-Alignment-Profile erstellt. Sequenzkonservierungslogos wurden von WebLogo56 generiert.

Die Samen wurden auf halbkonzentrierte MS-Platten mit 1 % Zucker, ergänzt oder nicht mit der angegebenen Konzentration an Peptiden (Genescript, >75 % Reinheit, gelöst in Wasser) oder Östradiol (Stammlösung wurde in DMSO verdünnt) oder entsprechendem Lösungsmittel, platziert und darin aufbewahrt 48 Stunden lang bei 4 °C dunkel, bevor sie in eine Wachstumskammer bei 22 °C mit 16-Stunden-Licht-/8-Stunden-Dunkel-Zyklen überführt werden. Sämlinge wurden 7 Tage lang für Tests zur Hemmung des Wurzelwachstums durch Peptide oder 10 Tage lang für die genetische Unterdrückung der Wurzelwachstumsphänotypen von brx-3/ops-2 gezüchtet. Nach dem Scannen der Platten mit einem Epson-Scanner mit hoher Auflösung (600 dpi) wurde die Wurzellänge mit dem Single-Neurite-Tracer-Tool in Fidschi gemessen.

Die Promotorregion von CLE33 (876 bp vom Startcodon entfernt) wurde kloniert, um die Expression des GUS-Reportersystems voranzutreiben. Transgene Sämlinge wurden bei 37 °C in GUS-Färbepuffer (0,5 mg/ml X-Gluc, 100 mM Phosphatpuffer, 10 mM EDTA, 1 mM Kaliumferrocyanid, 1 mM Kaliumferrocyanid, 0,1 % Triton 70 % Ethanol. Die Bilder wurden mit dem Zeiss Axioplan-Mikroskop und dem Leica MDG36-Stereomikroskop aufgenommen.

Für die zellspezifische Expressionsanalyse wurden stromaufwärts gelegene Regionen von CLE26 (1615 bp), CLE45 (2513 bp) und CLE33 (876 bp) kloniert und verwendet, um die Expression einer kernlokalisierten Fusion bestehend aus H2B oder NLS und Citrin voranzutreiben. Zur Peptidbehandlung wurden homozygote transgene pCVP2:NLS-3xVenus-Keimlinge 22 Stunden vor der Fixierung auf frische Platten übertragen, die kein Peptid oder 100 nM CLE33p oder CLE45p enthielten.

Sämlinge wurden mit 4 % Paraformaldehyd (Sigma) in PBS mindestens 1 Stunde lang fixiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Proben über Nacht mit 0,2 % Calcofluor White, gelöst in einer ClearSee-Lösung57, gefärbt und mindestens 48 Stunden lang mit ClearSee geklärt. Die Bildgebung wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP5 mit den folgenden Einstellungen durchgeführt: Calcofluor-gefärbte Zellwand (Anregung bei 405 nm, Detektion bei 415–500 nm), Venus oder Citrin (Anregung bei 514 nm, Detektion bei 522–500 nm). 574 nm oder 524–600 nm).

N. bethamiana-Blätter wurden vorübergehend durch Infiltration mit A. tumefaciens transformiert, das ein Multi-Kassetten-Plasmid trug, das pUbi:CLE33-mCherry und p35s:Venus exprimierte. Nach 3 Tagen wurden die Blattscheiben nacheinander mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP5 für Venus (Emission bei 514 nm, Detektion von 524 bis 551 nm) und mCherry (Emission bei 561 nm, Detektion von 571 bis 650 nm) abgebildet.

Fünf Tage alte Sämlinge wurden in neue Platten mit 1 µM Östradiol oder der äquivalenten Menge Lösungsmittel (DMSO) überführt. Nach 16 Stunden wurden die Sämlinge in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Gefrorene Proben wurden in einer Mühle mit Metallperlen gemahlen. Die RNA wurde mit dem MagMAX Plant RNA Isolation Kit (Applied Biosystems) extrahiert. Die verbleibende DNA wurde durch eine 2 M LiCl-Fällung entfernt. Die cDNA-Synthese wurde mit dem SensiFAST cDNA-Synthesekit (Meridian) durchgeführt. Quantitative PCRs wurden mit Fast Start Universal SYBR-green Master (Roche) mit Primern aus der Ergänzungstabelle 1 durchgeführt. Die Bedingungen des Thermocyclers (Mic qPCR Cycler, biomolecular systems) waren: 95 °C 2 min, 45 Zyklen von 95 °C 15 s, 58 °C 10 s, 60 °C 50 s, gefolgt von einer Dissoziationskurvenanalyse. Die Expressionswerte wurden auf Actin normalisiert.

Wir haben statistische Analysen mit R v4.0.2 innerhalb der Rstudio-Schnittstelle durchgeführt. Wir verwendeten eine Protokolltransformation für die Wurzellänge und den Abstand der QC-Protophloem-Zellidentität. Die statistische Signifikanz wurde durch ANOVA bestimmt, gefolgt von einem Post-hoc-Tukey-Test für Mehrfachvergleiche. Für die Lückenzellhäufigkeit verwendeten wir einen χ2-Test mit einer Benjamini-Hochberg-P-Wert-Korrektur. Im Allgemeinen wurde die Stichprobengröße basierend auf der in Vorversuchen beobachteten Variabilität ausgewählt. Für Tests mit auf Platten gezüchteten Sämlingen wurden mehrere Platten pro Bedingung verwendet, um die Variabilität des Platteneffekts zu begrenzen. Wir haben mindestens zweimal einen Wurzelwachstumstest und eine Wurzelprotophloemanalyse mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Das Expressionsmuster von CLE33 wurde von mehr als einem Dutzend T1-Transkriptionsreporterlinien abgeleitet. Die Expressionsanalyse mittels qPCR wurde einmal mit vier technischen Replikaten durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Ergänzende Datensätze, die diese Studie unterstützen, wurden an Dryad übermittelt und können über diesen Link gefunden werden: https://doi.org/10.5061/dryad.x69p8cznw. Zu diesen Datensätzen gehören die numerischen Quelldaten für Grafiken und Diagramme, die in der Excel-Datei zu finden sind, originale konfokale Bilder in den Formaten lif und lsm sowie Gen-Alignments im fas-Format. Alle weiteren Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Dr. Bojan Gujas für die Weitergabe der transgenen Linie (pCVP2:NLS-Venus) und die technische Beratung zur Phloemmikroskopie. Wir danken der Bioimage Core Facility der Universität Freiburg und der Adolphe Merkel Imaging Facility. Diese Arbeit wurde durch den Ambizione SNSF Grant (PZ00P3_179745) an OH, den COST SNSF Grant (IZCOZ0_189892) an OH und zusätzliche Mittel der Universität Freiburg an OH finanziert

Institut für Biologie, Universität Freiburg, Chemin du Musee 10, 1700, Freiburg, Schweiz

Samy Carbonnel, Salves Cornelis & Ora Hazak

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Narbe. und OH konzipierte Forschung; Narbe. und S.Cor. durchgeführte Forschung; S.Car analysierte die Daten und erstellte Zahlen; OH hat den ersten Entwurf geschrieben; OH, S.Car. und S.Cor. gemeinsam das Manuskript redigiert; OH betreutes Projekt; OH hat eine Finanzierung erhalten.

Korrespondenz mit Ora Hazak.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: David Favero.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Carbonnel, S., Cornelis, S. & Hazak, O. Das CLE33-Peptid unterdrückt die Phloemdifferenzierung über autokrine und parakrine Signale in Arabidopsis. Commun Biol 6, 588 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04972-2

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Eingegangen: 13. April 2023

Angenommen: 23. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04972-2

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